HE染色全名为苏木精(hematoxylin)和伊红(eosin)染色方法，是最基本的也是最重要的病理学染色技术。

HE切片是病理医生得以做出正确诊断的关键。HE染色是目前国内外病理诊断上广泛采用的 常规染色方法。切片质量的好坏，可直接影响疾病诊断的及时与准确性。因此，能制作出一张高质量的HE染色切片，是必须掌握的技术之一。

01染色原理

1.细胞核染色原理：

苏木精为碱性天然染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性燃料以离子键或氢键结合而被染色。苏木精在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

2.细胞浆染色原理：

细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时，大于蛋白质的等电点pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染色，现时胞核也被染色，核和胞浆难以区分。因此必须把pH调至胞浆等电点以下，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织，嗜伊红颗料等被感染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。

3.分化作用：

染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液，因酸能破坏苏木精的醌型结构，使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后，必须用0.5%盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去，再进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此，在HE染色中分化是极为关键的一步。

4.返蓝作用：

分化之后，苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色，在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色，故分化之后，立即用水除去组织切片上的酸而终止分化，再用弱碱性水（0.2%氨水）使苏木精染上的细胞核呈现蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝，但所需时间较长。

02染色步骤

固定液：常用95%乙醇和冰丙酮

苏木精染液：称取苏木精粉0.5g，铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中，然后取NaIO 31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均匀，滤纸过滤，备用。

伊红染液：称取0.5g水溶性伊红染液，溶于100ml蒸馏水中。

稀盐酸乙醇溶液：用75%乙醇配制1%盐酸。

系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶。

1.样品制备：

对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1×105/ml，滴加于盖玻片上(置于6孔板中)，培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS 洗涤3次。

2.样品固定：

95%乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次1min。

3.染核：

苏木素染液染色2-3min，自来水洗涤。

4.分色：

镜下观察，若细胞核染色过深，用1%盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤。

5.染胞质：

浸入伊红染液染色1min，自来水洗涤。

6.吹干或自然晾干细胞 爬片后，中性树胶封片。

注：若细胞用4%多聚甲醛固定，则染色时间相应延长，苏木素染色12-15min，伊红5min即可。

实验结果：细胞核呈蓝色，细胞质，肌纤维，胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。钙盐和细菌可呈蓝色或紫蓝色。

03注意事项

1.染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。 

2.切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚（晰）而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。 

3.切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。 

4.在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。

5.切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。 

6.最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。 

7.避免切片污染。出现切片污染，污染物遮盖该部位的细胞或组织难以观察期形态改变。应定期过滤各种染液和试剂以避免其中的沉淀物所引起的污染。

8.冬季室温低时（14℃以下），二甲苯应在水浴缸中适当加温到30℃后再脱蜡，以避免因脱蜡不完全引起的染色不均匀呈雾化状态。

04常见问题

优质的HE染色切片应该具备切片完整、无皱褶、细胞核着色清晰呈蓝色、细胞质呈鲜红色、核仁核膜核内染色质颗粒清晰，核质蓝红分明、对比清晰、透明度好等属性；劣质的HE染色切片会出现切片不完整，染色灰暗，红蓝对比不明显，有甚者染色后的切片镜下呈云雾状、组织结构不清楚等状况，对于科研党和病理检验工作者来说，想要一张好的组织HE染色图，看似简单但也不简单。目前，我们收集了一些导致组织切片染色不佳的原因及解决办法，希望对大家的科研工作有一定的帮助。

1.切片污染：包括染液的污染和组织污染

所谓染色的污染，是由于苏木精染液的氧化膜或伊红染液的絮状沉淀和其他试剂中的沉淀物所致。污染物遮盖该部位的细胞或组织而难以观察期形态改变。这种污染可通过定期的过滤各种染液和试剂而避免。而所谓的组织污染是由于切片和贴片过程中，被其他病例的组织和细胞污染。如果是不同类型的组织，容易在显微镜下发现；如果是相同类型而不同病变的组织污染，不容易在镜下发现，可导致误诊。因此在摊片时要非常小心，恒温贴片盆的水要常常更换或于每例贴片后用纸在水面及时把残余的蜡片拖走，以保证不污染。还有，取材时也可能造成组织污染，在甲例取材后，如不及时把取材台和刀剪冲洗干净，若留下残余组织，在乙例取材时把甲例的残余组织误作为乙例取材，同时放进脱水盒内，这样同一切片内，包括甲乙两例组织，这种组织污染也可产生严重后果。  

2.细胞核染色苍白、暗淡，苏木素染色过浅

造成此类问题的原因可能有3个，切片在苏木精染色液停留时间过短，苏木素染色液过度氧化，失去染色能力，盐酸酒精的分化步骤处理时间过长。此类问题可以更换新的苏木素及调节染色和分化时间来解决。  

3.染色不均匀不透亮呈雾化状态

即部分组织和细胞染色尚可，部分组织模糊不清楚，这种染色组织无法诊断。其原因是由于染色时二甲苯脱蜡不彻底，导致组织处理不当。常见于冬季室温低时，二甲苯的脱蜡能力降低，或使用多次脱蜡的二甲苯所致，克服办法是在冬季室温低时(14℃以下)，把二甲苯缸在水浴缸中适当加温到30℃再脱蜡，或更换新的二甲苯。  

4.切片在脱蜡后出现大片白色的斑点

由于烤片温度太低，玻片在脱蜡前没有充分烤干净组织中的石蜡；切片在二甲苯停留时间不足，或二甲苯使用过久，造成脱蜡不尽。若烤片时间过短，则可能导致切片脱落的现象。出现白色斑点是由于切片在二甲苯停留时间不足或脱蜡用的二甲苯使用过久造成，此时切片可以退回到二甲苯停留时间相对长些，或更换新的二甲苯，然后进行重新染色程序的染色。

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