【实验原理】

细胞转染是一种将外源分子（如DNA、RNA等）导入真核细胞的实验技术，广泛应用于基因治疗、基因功能研究等领域。本文将详细介绍五种主要的细胞转染方法：脂质体介导法、病毒介导法、电穿孔法、磷酸钙法及化学介导法。

【实验步骤】

细胞传代

(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。

(2)弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。

(3)用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟（37。C，5%CO2）。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。

(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。

(5)用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。

(6)将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。

(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。

(8)将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。

(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。

细胞转染

（1）转染试剂的准备

A.将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。

B.震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。

（2）选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。

（5）将混合液在室温放置10—15分钟。

（6）吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。

（7）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。

（8）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。

第二次细胞传代

（1） 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。

（2） 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新放入培养皿中。

（3） 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

筛选

转染细胞筛选

1．确定抗生素作用的最佳浓度：

不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。

（1） 提前24 小时在96 孔板或24 孔板中接种细胞8 孔，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2 孵箱中37℃培养过夜。

（2） 将培养液换成含抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0, 50, 100, 200,400, 600, 800 和1000μg/ml）。

（3）培养10-14 天以绝大部分细胞死亡浓度为准,一般为400-800μg/ml,筛选稳定表达克隆时可比该浓度适当提高一个级别维持时使用筛选浓度的一半.

2．转染按前面的步骤进行。

3．转染72 小时后按1:10 的比例将转染细胞在6 孔板中传代，换为含预试验中确定的抗生素浓度的选择培养基。在6 孔板内可见单个细胞，继续培养可见单个细胞分裂繁殖形成单个抗性集落，此时可用两种方法挑选单克隆。

（1） 滤纸片法：用消毒的5x5mm 滤纸片浸过胰酶,将滤纸片贴在单细胞集落上10-15 秒，取出粘附有细胞的滤纸片放于24 孔板中继续加压培养。细胞在24 孔板中长满后转入25cm 培养瓶中,长满后再转入75cm 培养瓶中培养。

（2） 有限稀释法：将细胞消化下来后做连续的10 倍稀释（10-2—10-10），将每一稀释度的细胞滴加到96 孔板中培养，7-10 天后，选择单个克隆生长的孔再一次进行克隆。

4. ELISA 或Western blot 检测单克隆细胞中外源蛋白的表达情况由于不同克隆的表达水平存在差异因此可同时挑选多个克隆选择表达量最高的克隆传代并保种。

【常见问题与注意事项】

核酸质量

DNA: 内毒素会导致转染效率显著下降，特别是对内毒素敏感细胞比如原代细胞、悬浮细胞和造血细胞或者想要获得最高的转染效率和最低的细胞毒性，因此最好选择内毒素含量较低的质粒抽提试剂盒。

siRNA: 需合理的计算siRNA的浓度，过多的siRNA会导致细胞毒性甚至死亡。

 细胞质量

细胞密度：不同的转染试剂，对细胞密度的要求不尽相同。在进行不同核酸或不同细胞系的转染时，需要根据说明书再次优化实验条件。

细胞状态：不同细胞使用不同的培养基，血清和其他添加物。高的转染效率需要细胞保持良好的状态，通常在转染前24小时分细胞，这能够提供正常细胞代谢，增加对外源DNA摄入的可能。除此之外，要保证避免细菌，支原体或真菌的污染。

转染方法及转染试剂

根据所转染细胞及底物选择适合的转染方法及转染试剂。理想的细胞转染应该是转染效率高；毒性低；方法简单；省时省力。

【交付标准】

1. 实验报告 

2. 真实实验结果

3. 原始图片

4. 实验原始数据

5. 剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）

康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

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