【实验原理】

微生物多样性测序是对环境样品中细菌（16S rDNA）、真菌（18S/ITS）、功能基因等基因的DNA进行特定长度的PCR扩增并对扩增产物进行测序的分析，可实现对环境样品中的优势物种、稀有物种和一些未知物种进行检测，精准解析微生物在种属水平上的组成和丰度情况，是当前研究环境微生物多样性及群落组成差异的重要技术手段。

【实验步骤】

1.文件准备:确保所有输入文件已就绪。

2.数据合并:合并样本数据以进行质控。

3.质控处理:使用 cutadapt 进行序列修剪。

4.OTU表生成:通过去噪生成操作分类单元(OTU)表。

5.系统发育树构建:为OTU表中的代表性序列构建系统发育树。

6.物种注释:使用分类器对OTU表中的序列进行物种注释。

7.多样性分析:进行Alpha和Beta多样性分析。

8.差异分析:使用ANCOM、PicRust和LEfSE进行组间差异分析。

【常见问题与注意事项】

01. 什么是微生物种群多样性测序？

微生物种群鉴定为通过高通量测序对细菌的 16S rRNA 基因和真菌的 18S rRNA 基因、 ITS 序列进行测序，进而鉴定微生物种群。16S rRNA 基因（18S rRNA 基因）指的是细菌 （真菌）基因组中编码核糖体16S rRNA (18S rRNA）的对应的 DNA 序列，也就是 16S rRNA (18S rRNA）的编码基因，其包括 9 个高变区域（V1-V9）和 10 个保守区域。ITS（Internal Transcribed Spacer），即核糖体内转录间隔区，ITS 分为两个区域：ITS1/ITS2，ITS1 位于真核生物核糖体 rRNA 基因序列的 18S 和 5.8S 之间，ITS2 位于真核生物核糖体 rRNA 基因序列的 5.8S 和 28S 之间。通过对特定高变区测序获取微生物的物种及丰度信息。

02. 某个物种在提供的分析结果中未检测到，是否能说明样品中不存在该物种？

理论上，经分析后样本中没有这类物种的信息，意味着样品中是没有这类物种。实际上存在两种情况会影响这一判断，一是所用的PCR引物有偏好，即样品中存在该类物种（一般丰度较低），但是PCR未扩增出来，因此后续测序检测不到；其次是数据库中缺少此类物种的相关信息，因此即使测得的序列中含有该物种，但是分析时比对不到此物种信息。

03. 关于微生物多样性项目的实验设计，为什么要设置生物学重复？

在多样性项目的设计中，是否设置生物学重复的确是一个很重要的问题。尤其是关注差异分析的研究项目，而在差异分析中，基本都会涉及有参和无参两种检验方法，如 t 检验， 秩和检验等。无论哪种检验方法都需要用到诸如方差，均值等计算，必须要有生物学重复才能产生数值。所以首先生物学重复从数据分析原理上讲是必须的。此外，多样性研究的环境样本等受到的影响因素较为复杂，单纯的一个样本代表一个分组，结果是不可靠的，生物学重复的设置使研究更有统计学的意义。

04. 生物学重复，技术重复与混样的差别？

不限于多样性研究，在常规实验设计中，生物学重复、技术重复和混样一直都是影响实验设计的关键问题之一。这里分别介绍一下这三个概念及设置的意义。

生物学重复，简单说就是一组进行相同处理的不同样本。生物学重复的设置，是用于概 括性结论的验证，用一类样本的相似性结果概括总结这一类样本的特征。

技术重复，在实验过程中，技术性操作也可能引入一些误差或偏离，为了说明操作的稳定性，证明结果中的变异在合理范围内，则需要进行技术性重复操作。以测序为例，同一个土壤样本测三次，这三次结果之间即形成一组技术重复，用以说明建库测序实验结果的稳定性。

混样，顾名思义，混样就是将多个样本混匀（多为等量混匀），混样的意义一方面拉平了单个样本间的差异，另一方面也使混匀后的样本更具有代表性，更能代表此一类样本的特征。

这三种样本设计方式可以在实验设计中联合考虑设计，也可以单独应用，视不同的研究目的进行选择。具体问题可咨询我公司技术人员。

05. 常见实验样本取样指南？

土壤样本取样：选择具有代表性的土壤，使用无菌工具，采集5-10cm深的一定量的土壤，去除杂质，分装标记，每袋样品约5-10g，密封后立即低温保存。

粪便样本取样：用无菌粪便采集器或其它灭菌器皿收集粪便样品，分装标记并立即低温保存（也可先标记并低温保存后分装）。每个样本分装几管灭菌离心管，每管0.2g左右。小鼠个体较小，粪便不足0.2g时可将生物学重复样本混合。注意粪便样品不要在空气中暴露太长时间，避免污染和降解。对于珍贵和较难收集的样品，建议老师们进行备份

【交付标准】

1. 实验报告 

2. 真实实验结果

3. 原始图片

4. 实验原始数据

5. 剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）

康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

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