【实验原理】

流式细胞术是20世纪60年代末发展起来的一项新技术，它利用流式细胞术快速定量地分析细胞群的物理和化学特性，并根据这些物理和化学特性准确地选择细胞。

【实验步骤】

1. 制备细胞群，离体样品时用机械分离方法轻柔匀浆化新切组织，通过密度梯度离心法分离不同类型细胞。

2. 贴壁细胞需先用酶液或钙螯合剂与吸附的细胞培养容器解离。

3. 悬浮细胞可直接进行计数和活力检测。

4. 用荧光染料标记抗原，注意抗原密度与荧光染料亮度相匹配。

5. 用流式细胞仪进行检测和分析。

【常见问题与注意事项】

一、常见问题

（一）细胞聚集

1. 原因：样本制备过程中操作不当、细胞浓度过高、样本中有杂质等。

2. 解决方法：轻柔操作，调整细胞浓度，去除样本中的杂质。可以通过过滤或离心的方法去除细胞聚集物。

（二）荧光强度弱

1. 原因：荧光染料浓度过低、细胞活性差、仪器检测参数设置不当等。

2. 解决方法：增加荧光染料的浓度，提高细胞活性，调整仪器检测参数，如增加激光功率、调整增益等。

（三）光谱重叠

1. 原因：同时使用多种荧光染料，且染料之间的光谱重叠严重。

2. 解决方法：选择合适的荧光染料组合，调整染料的浓度和滤光片，减少光谱重叠。可以通过进行荧光补偿来校正光谱重叠的影响。

（四）数据变异大

1. 原因：样本制备的重复性差、仪器性能不稳定、数据分析方法不当等。

2. 解决方法：提高样本制备的重复性，定期对仪器进行校准和维护，选择合适的数据分析方法，如采用统计学方法对数据进行分析。

二、注意事项

（一）样本制备

1. 细胞样本应尽量保持新鲜，避免长时间存放导致细胞活性下降。如果需要保存，可采用适当的方法如低温保存，但要注意避免反复冻融对细胞造成损伤。

2. 样本制备过程中要轻柔操作，避免剧烈吹打或振荡，以防止细胞破碎。

3. 确保样本中的细胞浓度适中，过高的细胞浓度可能导致细胞聚集，影响检测结果；过低的细胞浓度则可能导致检测信号弱。一般来说，细胞浓度在 1×10⁶ 至 1×10⁷ 个细胞 / 毫升较为合适。

（二）荧光染料选择

1. 根据实验目的选择合适的荧光染料，不同的荧光染料具有不同的激发和发射波长，要确保所选择的荧光染料与流式细胞仪的激发光源和检测通道相匹配。

2. 注意荧光染料的稳定性和光漂白性，尽量选择稳定性好、光漂白性低的染料。

3. 避免荧光染料之间的光谱重叠，以免影响检测结果的准确性。如果需要同时使用多种荧光染料，可以通过调整染料的浓度和选择合适的滤光片来减少光谱重叠。

（三）仪器操作

1. 在使用流式细胞仪前，要熟悉仪器的操作方法和注意事项，严格按照操作规程进行操作。

2. 定期对仪器进行校准和维护，确保仪器的性能稳定。校准包括光路校准、荧光补偿校准等。

3. 注意仪器的清洁和消毒，避免样本之间的交叉污染。使用完仪器后，要及时清理样本管路和检测区域，并用适当的消毒剂进行消毒。

（四）数据分析

1. 在进行数据分析时，要选择合适的分析软件，并熟悉软件的功能和操作方法。

2. 注意数据的质量控制，去除异常值和背景噪声。可以通过设置门限、调整参数等方法来提高数据的质量。

3. 对实验结果进行合理的解释和分析，结合实验目的和生物学背景，避免单纯依赖数据而忽略生物学意义。

【交付标准】

1.  实验报告 

2. 真实实验结果

3. 原始图片

4. 实验原始数据

5. 剩余物料在周期内可返还（超过周期，不予返还）

康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

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