髓间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，间充质干细胞最初是在骨髓中被发现，因其具有多向分化潜能、来源广泛，获取简单，易于分离培养，体外增殖力强等特点而日益受到人们的关注。目前发现其具有能够分化形成至7种组织细胞，如成骨细胞、成脂细胞等组织细胞的潜能。可以为骨、肌肉等结缔组织的损伤修复提供潜在的细胞来源，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。

实验原理

 间充质干细胞（MSC）是干细胞的一种,具有向多种类型细胞分化的能力,可以分化为神经、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种细胞。茜素红染色法是MSC细胞成骨诱导实验操作和鉴定间充质干细胞向成骨细胞分化的一个重要方法，其原理是间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中,在细胞表面沉积钙盐,形成钙结节,钙离子与茜素红螯合,被染成红色或者紫红色。

实验步骤

01

细胞接种

取对数生长期的细胞，按照适宜细胞密度接种至包被后的培养器皿中，于37℃，5% CO2培养环境下培养至汇合度70-80%，弃掉上清，加入成骨诱导分化培养基。

02

细胞分化诱导

每2-3天更换成骨诱导培养基，于37℃，5%CO2培养环境下培养约14-21天，并注意观察细胞形态变化。根据细胞钙盐结晶析出和钙质结节形成的情况，决定终止细胞诱导的时间，进行染色鉴定。

03

细胞固定

根据茜素红试剂说明书进行细胞固定。

04

茜素红染色

根据茜素红试剂说明书加入适量茜素红染液染20-30min，吸去茜素红染液，用蒸馏水充分洗涤。

05

结果处理

显微镜下观察成骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。诱导成功时，钙质结节会与茜素红染料结合后呈现红色或橘红色。

注意事项

1. 实验操作过程中要避免污染。

2. 接种细胞前可对培养器皿进行包被处理，以防止成骨诱导后期细胞出现成片脱落的现象。

3. 诱导后细胞易脱壁，换液操作要尽可能轻。必要时可进行半量换液。

4. 茜素红染色时，若染色效果较浅可以适当延长时间，或选做苏木素复染处理。

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