细胞增殖是生物体的重要生命特征，指细胞在周期调控因子的作用下，通过DNA复制等反应，完成细胞分裂的过程。增殖检测一般是分析分裂中细胞的数量变化，进而反映细胞的生长状态及活性，目前广泛应用于肿瘤生物学，分子生物学，药代动力学等领域。

细胞增殖检测的方法众多，应用非常广泛，按检测原理主要分为4 类：检测DNA合成、检测代谢活性、检测细胞增殖相关抗原和检测ATP浓度。其中，细胞DNA合成检测是通过测定细胞的DNA合成量来评价细胞的增殖能力，直接测定DNA合成是检测细胞增殖最准确的方法，它是测定物质毒性、评估药物安全评价、判断细胞健康、细胞增殖等研究方向常用方法之一，常用的检测试剂主要是EdU、BrdU等。

实验原理

EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）与BrdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，它们能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子，然后分别利用免疫荧光技术、与Apollo荧光染料特异性反应检测细胞增殖情况。

传统的BrdU有一大缺点，就是需要变性DNA后才能与抗体结合，但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。而EdU检测法更简单、更快速、更准确，不需要严苛的样品变性(酸解、热解、酶解)处理，有效地避免了样品损伤，有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，具有更高的灵敏度和更快的检测速度。这是一种新型的非放射性同位素细胞增殖检测的方法，在细胞培养、实体组织及临床研究中得到了广泛的应用。该技术可用于细胞成像、流式、细胞示踪、DNA损伤修复检测、线粒体活性检测以及病毒增殖活性检测等。

实验步骤

细胞培养

收集细胞计数，调整细胞悬液以2.5×10^5个/孔接种于提前置有爬片的12孔板中，过夜培养。

药物处理

按照不同分组处理细胞，继续培养48 h。

EdU标记

用10 mM EdU溶液在无血清培养基中制备2 X EdU工作溶液，将2 X EdU溶液添加到等体积的培养基中，37 ℃孵育2 h。

细胞固定

去除培养基，加入0.5 mL 4%多聚甲醛固定液，室温固定15 min。

通透

去除固定液，PBS洗3次，加入0.5 mL 0.3% Triton X-100通透剂，室温孵育15 min。

Click反应

去除通透剂，PBS洗3次，配制Click Additive Solution，每孔加入200 μL反应液，室温避光孵育30 min。

封片

去除反应液，PBS洗3次，加入含DAPI的抗荧光衰减封片剂，室温孵育10 min。

拍照

注意事项

1. 加入含有Edu的培养基时，培养基的用量以没过细胞为适宜。

2. 根据培养细胞种类不同，确定细胞生长周期，再进一步确定Edu培养基的培养时间，大多数细胞为2小时培育时间。

3. 细胞类型、培养液种类、细胞密度、细胞增殖速度等多方面的因素会影响EdU掺入到细胞中的量，因此初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索。

4. 染色完成后，最好立即进行观察。如若条件限制，请4℃避光保存，保存时间不宜过长，不超过3天。

5. Click Additive配制成溶液后请注意适当分装。如果溶解后有白色物质析出，可上下颠倒多次，待全部溶解后使用。