流式分选

通过不同的荧光素标记样本中一种或多种细胞，再经由流式细胞仪区别不同细胞的光散射和荧光特征，将不同细胞分离。

流式分选的步骤相对来说比较固定：

制备单细胞悬液；

细胞染色；

细胞分选；

后续细胞培养、分析。

其中比较困难的就是关于抗体偶联荧光素的选择：比如，已经确定好了要分选细胞的marker，但是偶联的荧光素不知道怎么选。一般来说需要遵循三个原则：

01

根据仪器配置选择荧光素：多色标记荧光素搭配时还应当每个通道只选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以互相搭配；

02

根据抗原表达强弱合理分配荧光素：若抗原为高表达，可以将其与荧光强度较低的荧光素抗体相结合；

03

选择光谱重叠小的荧光素：由于荧光素的宽发射谱的特点，荧光通道间有光谱重叠现象，因此选择荧光素组合时要将光谱叠加可能性减到最低。多色流式实验的时候往往需要通过补偿调节消除光谱重叠的影响。

总结

了解了两大常用的细胞分选方法后，应当如何选择呢?

流式分选可进行多参数分选以及不同荧光强度的分选，但对设备要求较高，对细胞刺激较大但分选灵活可以达到多方面的分选要求；

磁珠分选操作简单，分选速度快，细胞活性好，对设备和技术员的要求较低，但只能根据一个参数进行分选，而且也不能针对细胞胞内标记物进行筛选。

下面详细对比了磁珠分选和流式分选的优劣势：

如果磁珠分选能达到研究要求，一般首选磁珠分选，若磁珠分选达不到要求则再考虑用流式进行分选。

以磁珠分选PBMCs样本中人Tregs细胞为例，帮助大家更好的get要点:

Tregs是CD4+T细胞的一个亚群，最特异性的标签是核内转录因子Foxp3，还高表达IL-2α受体(IL2Ra)—CD25，经典的Treg标志是CD4+CD25+Foxp3+T。如果检测Tregs细胞，可以选择膜标记及核标记同时鉴定。但如果需要分选Tregs细胞并进行后续培养，就无法借助核转录因子Foxp3，因为磁珠分选只能进行膜蛋白的标记；流式分选标记Foxp3时，需要固定、透化步骤，会导致细胞死亡。所以分选Tregs细胞选择的标记物一般为：膜表面蛋白CD4、CD25。

其分选策略为先阴性分选再阳性分选：

1、首先使用biotin偶联的混合抗体(CD8、CD14、CD15CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCRy/o、和CD235a)标记所有CD4-细胞，再加入Anti-BiotinMicroBeads，那么先经过磁场流出的是CD4+细胞；

2、在预富集的CD4+细胞中再加入CD25磁珠进行阳性标记待流出未标记组分后，再进行洗脱，即可获得高纯度的CD4+CD25+调节性T细胞。

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