线粒体——细胞的“能量中枢”与“命运开关”

在微观的细胞世界中，线粒体不仅是制造能量的“发电厂”（95%的ATP由此产生），更是调控生死决策的“指挥中心”。当线粒体功能健全时，它们通过膜电位（ΔΨm） 驱动ATP合成、钙稳态与信号传导；一旦功能崩溃（如凋亡、疾病中），则会触发活性氧（ROS）爆发与线粒体网络解体——这些变化如同细胞命运的“早期警报”。

为什么需要精准检测线粒体？

1. 功能监控（ΔΨm）：

• 膜电位是线粒体健康的“电压表”，其崩溃（如JC-1红绿比↓或TMRE荧光↓）是凋亡/坏死的最早标志。

2. 结构评估（质量）：

• MitoTracker Green FM标记总线粒体池，揭示线粒体数量增减与形态异变（肿胀/碎片化），是“细胞器人口普查”的金标准。

3. 危机预警（ROS）：

• DCFH-DA捕捉整体氧化风暴，MitoSOX Red精准定位线粒体超氧阴离子，为氧化损伤提供“分子雷达”。

一、线粒体膜电位检测

线粒体膜电位（ΔΨm）是维持线粒体功能（如ATP合成、钙离子缓冲、活性氧产生和凋亡信号传导）的关键驱动力。检测其变化对于研究细胞能量代谢、细胞凋亡、神经退行性疾病、心血管疾病、癌症等至关重

JC-1染料

核心原理：浓度依赖的荧光转换

• JC-1 是一种独特的“双发射”亲脂性阳离子染料。• 低 ΔΨm（或低染料浓度）时： JC-1 主要以单体形式存在于细胞质中，发出绿色荧光（最大激发/发射波长约 510 nm / 527 nm）。• 高 ΔΨm 时： 由于线粒体基质带负电，带正电的JC-1 被大量摄取并在线粒体基质内积累。当浓度足够高时，JC-1 分子会聚集成 J-聚集体 (J-aggregates)。J-聚集体发出红色荧光（最大激发/发射波长约 585 nm / 590 nm）。• 关键指标： 检测的是 红色荧光（聚集体）与绿色荧光（单体）的强度比值 (Red/Green Ratio)。这个比值与ΔΨm 高度正相关：比值越高，ΔΨm 越高；比值越低，ΔΨm 越低。

主要优点：

1. 比值法抗干扰性强： 这是JC-1最大的优势。比值测量能有效抵消因细胞大小、形状、染料装载效率、探针浓度、仪器设置（如激光功率、PMT电压）差异以及光程差异（在显微镜下）等因素引起的误差。结果更可靠，定量性更好。2. 可视化清晰： 在荧光显微镜下，高ΔΨm的细胞/线粒体呈现明亮的红色（聚集体）和较弱的绿色（单体）；低ΔΨm时则呈现明亮的绿色（单体）和微弱的红色（或无红色）。这种颜色变化非常直观，易于识别细胞群体内或单个细胞内的异质性（如凋亡细胞vs健康细胞）。3. 广泛用于凋亡研究： ΔΨm崩溃是细胞凋亡早期的关键事件，JC-1比值下降是检测凋亡启动的经典标志。

主要缺点：

1. 优化要求高： 探针浓度、孵育时间、温度必须针对每种细胞类型严格优化。浓度过低无法形成足够聚集体，浓度过高可能导致单体荧光饱和或非特异性染色。2. 聚集体形成动力学： J-聚集体的形成并非瞬间完成，且在某些细胞类型或条件下（如线粒体膜成分改变）可能不完全，影响比值准确性。3. 光稳定性相对较差： 相较于TMRE，JC-1（尤其是红色聚集体）更容易发生光漂白，在长时间活细胞成像或需要高激光强度的共聚焦成像中受限。4. 光谱串扰： 需要仔细设置滤光片，确保绿色和红色通道之间有良好的分离，避免串色（Bleed-through）。5. 潜在毒性： 较高浓度或长时间孵育可能对某些细胞有毒性。

典型应用：

• 流式细胞术高通量检测细胞群体ΔΨm变化（如药物筛选、毒性测试）。• 荧光显微镜（尤其是宽场）观察ΔΨm在细胞群体或单个细胞内的分布和异质性。• 细胞凋亡的早期检测（核心应用）。• 评估线粒体功能状态。

TMRE染料

核心原理：电位依赖的荧光积累

• TMRE 是一种单发射的亲脂性阳离子染料（属于罗丹明家族）。• 其荧光强度（橙红色，最大激发/发射波长约 550nm / 576 nm）直接与线粒体摄取积累的染料量成正比。• 由于染料积累量由线粒体内膜两侧的电位差（ΔΨm）驱动（遵循能斯特方程），因此荧光强度（平均荧光强度 - MFI）与 ΔΨm 正相关：荧光越强，ΔΨm 越高；荧光越弱，ΔΨm 越低。

主要优点：

1. 优异的光稳定性： TMRE 的光稳定性非常好，特别适合长时间的活细胞动态成像，尤其是在共聚焦显微镜或高内涵成像系统上进行时间序列拍摄（Time-lapse）。2. 低细胞毒性： 在推荐的工作浓度下，TMRE 对细胞的毒性通常很低，对细胞生理状态干扰小，是活细胞成像的首选之一。3. 泄漏速率较慢：TMRE 从线粒体中泄漏的速度较慢，能更好地维持稳态荧光信号，利于动力学观察。4. 使用相对简单： 原理直观，操作流程相对标准化。5. 适合高分辨率成像： 与共聚焦、双光子显微镜兼容性好，能提供清晰的线粒体亚细胞定位图像。

主要缺点：

1. 依赖绝对荧光强度： 这是单色探针的主要局限。荧光强度受多种因素影响：

• 染料浓度： 必须精确控制并保持一致。• 装载效率： 受细胞类型、活力、孵育条件影响。• 细胞大小/形态/线粒体数量： 大细胞或线粒体丰富的细胞本底荧光更高。• 仪器设置： 激光功率、PMT增益、曝光时间等直接影响读数。• 光程/聚焦： 显微镜下不同焦平面或细胞厚度影响光强度。

2. 严格的对照需求： 为了准确解释结果，必须设置有效的阳性和阴性对照：

• 阴性对照 (ΔΨm 完全崩溃)： 通常在实验结束时加入线粒体解偶联剂（如 CCCP 或 FCCP，常用浓度 10-50 μM，孵育 5-30 分钟），使所有细胞的荧光降至最低基线水平（代表背景/非电位依赖的染色）。实验中细胞的MFI需要与这个对照值比较。• 阳性对照/未处理组： 健康细胞作为高ΔΨm的基准。

3. 无法直观显示异质性

• 不像JC-1有颜色变化，TMRE的单色信号在显微镜下不易直接目视区分ΔΨm高低（除非结合图像分析软件测量强度）。

典型应用：

• 活细胞实时成像（核心优势）： 共聚焦/双光子显微镜下监测单个细胞或细胞群ΔΨm的动态变化过程（如药物处理、代谢刺激、钙信号等引起的快速或慢速波动）。• 流式细胞术检测ΔΨm（需结合CCCP对照进行数据归一化）。• 研究电兴奋性细胞（如神经元、心肌细胞）的线粒体功能，其对微环境变化敏感。• 需要长时间观察的实验。

二、线粒体质量检测

MitoTracker Green FM：线粒体特异性结构标记探针

MitoTracker Green FM（MTG） 是一种高性能荧光染料，专为精准标记细胞内的总线粒体池而设计。其核心价值在于提供不依赖线粒体功能状态的结构性成像，成为研究线粒体质量（Mass）的首选化学工具。

高选择性与膜电位非依赖性

线粒体高度特异性：

• 通过优化亲脂性结构，MTG选择性蓄积于线粒体基质，与胞内其他细胞器（如溶酶体、内质网）无交叉染色，信噪比显著优于普通染料。• 标记全部线粒体：
染色不依赖线粒体膜电位（ΔΨm），可同时标记健康（高ΔΨm）与功能障碍（低ΔΨm/肿胀/碎片化）的线粒体，真实反映总线粒体的数量与形态分布。

卓越荧光特性

特性    科学优势    

明亮绿色荧光    激发/发射峰≈490/523 nm，兼容    

高光稳定性    抗光漂白能力优异，支持长时间活细胞动态成像（如线粒体融合/分裂追踪）    

超低背景    仅在疏水性线粒体脂质环境发光    

三、ROS检测

DCFH-DA：广谱ROS探针（以H₂O₂为主）

检测原理

1. 穿透与活化：

• 脂溶性DCFH-DA被动扩散进入细胞，被胞内酯酶（Esterase）水解为极性分子 DCFH（2',7'-二氯二氢荧光素），无法穿出细胞膜。

2. 氧化与发光：

• DCFH被ROS（主要是H₂O₂，也可被•OH/ONOO⁻氧化） 氧化生成 DCF（2',7'-二氯荧光素）。• 发射绿色荧光（最大激发/发射波长：Ex ≈ 488 nm, Em ≈ 525 nm），强度与ROS水平正相关。

适用场景

• 细胞整体ROS水平初筛（如药物/环境毒素诱导的氧化应激）。• 流式细胞术高通量检测（如免疫细胞呼吸爆发）。• 与线粒体/溶酶体探针联用（需避免光谱重叠）。

优点 vs 缺点

优点    缺点    

操作简单，成本低廉    特异性低    

兼容常规流式/FITC滤光片    光漂白强    

可半定量比较不同处理组    自发氧化    

pH敏感性    荧光强度受胞内pH影响    

MitoSOX™ Red：线粒体超氧阴离子（O₂•⁻）特异性探针

检测原理

1. 靶向蓄积：

• 修饰的二氢乙锭（DHE）衍生物，带亲脂性三苯基膦阳离子（TPP⁺），通过线粒体膜电位（ΔΨm）定向富集到线粒体基质。

2. 特异性氧化：

• 被线粒体内的 超氧阴离子（O₂•⁻） 氧化生成 2-羟基乙锭，与DNA结合后发射红色荧光（最大激发/发射波长：Ex ≈ 510 nm, Em ≈ 580 nm）。

适用场景

• 线粒体特异性O₂•⁻检测（如凋亡、缺血再灌注损伤、神经退行性疾病）。• 活细胞共聚焦动态成像（观察线粒体ROS时空变化）。• 评估线粒体靶向抗氧化剂效果（如MitoQ、SkQ1）。

优点 vs 缺点

优点    缺点    

精准定位线粒体    价格昂贵（约为DCFH-DA的10倍）    

对O₂•⁻特异性高    （强于DHE）    

光稳定性优于DCFH-DA    部分细胞类型可能滞留胞质（需优化浓度）    

兼容TRITC/PE滤光片    高浓度可能抑制线粒体呼吸链    

四、文献应用实例

实例1：流式细胞术分析线粒体膜电位，质量以及ROS水平

文章段落呈现

1.重悬与染色

将细胞沉淀重悬于 100 μl 1× 结合缓冲液（BD Bioscience 产品）中，加入以下荧光染料及抗体使得工作浓度达到相应要求：

• 线粒体标记：Mitotracker Green-FM（100 nM，绿色荧光，标记线粒体）；• 活性氧（ROS）检测：H₂DCFDA（1 μM，进入细胞后被 ROS 氧化发出绿色荧光）；• 线粒体膜电位（MMP）检测：TMRE（100 nM，红色荧光，依赖膜电位积聚于线粒体）；• 细胞表面标志物抗体：• CD45-FITC（绿色荧光，标记白细胞共同抗原）；• CD11b-PE（橙色荧光，标记单核细胞 / 巨噬细胞 / 小胶质细胞）；• GLAST-APC（红色荧光，标记星形胶质细胞），均按 1:100 稀释。• 孵育条件：避光孵育 15 分钟，随后加入 200 μl 1× PBS 稀释。

2.流式细胞术分析

• 检测参数：每样本采集 10,000 个事件，通过流式细胞仪分析各荧光通道的信号强度，分别量化线粒体质量（Mitotracker Green）、ROS 水平（H₂DCFDA）、MMP（TMRE）及细胞分型（CD45/CD11b/GLAST）。

参考文献[1]:Navarro E, Gonzalez-Lafuente L, Pérez-Liébana I, et al. Heme-Oxygenase I and PCG-1α Regulate Mitochondrial Biogenesis via Microglial Activation of Alpha7 Nicotinic Acetylcholine Receptors Using PNU282987. Antioxid Redox Signal. 2017;27(2):93-105. doi:10.1089/ars.2016.6698

实例2：流式细胞数分析线粒体膜电位（MMP）与线粒体质量

文章段落呈现

1. 试剂与细胞准备

• 细胞株：K562G、K562R 细胞。• 染色试剂：• JC-1 试剂（2 μM，货号 #HY-15534，品牌#MedChemExpress），用于检测线粒体膜电位。• MitoTracker Green（0.1 μM，货号 #HY-135056，品牌#MedChemExpress），用于标记线粒体质量。

2. 染色操作流程

• 分组染色：• MMP 检测：取细胞悬液，加入 JC-1 试剂（终浓度 2 μM），37℃避光孵育 30 分钟。• 线粒体质量检测：另取细胞悬液，加入 MitoTracker Green（终浓度 0.1 μM），37℃避光孵育 30 分钟。• 洗涤与重悬：孵育结束后，用 PBS 洗涤细胞 2 次，1000 rpm 离心 5 分钟，弃上清，重悬于 500 μL PBS 中。

3. 流式细胞术分析

• 仪器参数：使用流式细胞仪（如 BD LSR II），设置 488 nm 激光激发：• JC-1 检测：收集 530 nm（绿色，单体）和 590 nm（红色，聚集体）荧光信号，计算红绿荧光比值。• MitoTracker Green 检测：收集 516 nm 绿色荧光信号，量化线粒体质量。
参考文献[2]：Feng L, Ding R, Qu X, et al. BCR-ABL triggers
a glucose-dependent survival program during leukemogenesis through the
suppression of TXNIP.Cell Death Dis. 2023;14(4):287. Published 2023 Apr 24. doi:10.1038/s41419-023-05811-2

实例3：流式细胞术分析线粒体活性氧（ROS）和膜电位

文章段落呈现

Figure 3A-B：线粒体 ROS 检测（MitoSOX 染色）

实验设计与目的

• 检测指标：线粒体超氧化物（ROS）水平，验证 ACLY 抑制剂诱导的氧化应激。• 处理条件：35μM或70 μM ACLY 抑制剂处理 THP-1 细胞 3，6，9，12 小时。

试剂准备：

• MitoSOX™ Red（品牌：Thermo Fisher Scientific,货号：M36008）用无血清培养基稀释至 5 μM 终浓度。

细胞处理：

1. 收集处理 3，6，9，12 小时的细胞，1500 rpm 离心 5 分钟，PBS 洗涤 1 次。2. 重悬于无血清培养基，加入 5 μM MitoSOX™ Red，37℃避光孵育 10 分钟。3. 预冷 PBS 洗涤 2 次，重悬于 1% FBS-PBS，立即上样流式细胞仪。

检测参数：

• 流式细胞仪：BD LSR II，488 nm 激光激发，PE检测通道（580 nm 发射光检测红色荧光）。• 数据分析：FlowJo v10.9.0，计算高 ROS 细胞群（MitoSOX 高荧光）的比例。

3. 关键结果

• 70 μM ACLY 抑制剂处理后，高 ROS 细胞比例从 0 小时的约 10% 升至 12 小时的 40%，证实 ROS 显著积累。

Figure 3C-D：线粒体膜电位（MMP）检测（TMRE 染色）

实验设计与目的

• 检测指标：线粒体膜电位（ΔΨm），验证 ACLY 抑制剂诱导的 MMP 损伤。• 处理条件：70 μM ACLY 抑制剂处理 THP-1 细胞 6 小时。

试剂准备：

• TMRE（品牌：MedChemExpress, 货号：HY-D0985A）用无血清培养基稀释至 100 nM 终浓度。

细胞处理：

1. 收集处理 6 小时的细胞，1500 rpm 离心 5 分钟，PBS 洗涤 1 次。2. 重悬于无血清培养基，加入 100 nM TMRE，37℃避光孵育 15 分钟。3. 预冷 PBS 洗涤 2 次，重悬于含 1% FBS-PBS，立即检测。

检测参数：

• 流式细胞仪：BD LSR II，488 nm 激光激发，PE检测通道（575 nm发射光检测红色荧光）。• 数据分析：FlowJo v10.9.0，计算低 MMP 细胞群（TMRE 低荧光）的比例。

关键结果

• 70 μM ACLY 抑制剂处理 6 小时后，低 MMP 细胞比例从 0 小时的约 5% 升至 30%，表明 MMP 显著降低。
参考文献[3]:Watanabe A, Tipgomut C, Totani H, et al. Noncanonical TCA cycle fosters canonical TCA cycle and mitochondrial integrity in acute myeloid leukemia. Cancer Sci. 2025;116(1):152-163. doi:10.1111/cas.16347

实例4流式细胞术分析线粒体ROS，膜电位，质量

文章段落呈现

 线粒体膜电位（ΔΨm）检测

方法：

• 染料：使用 TMRE（Tetramethylrhodamine ethyl ester）（货号 HY-D0985A，品牌 MedChemExpress）。

步骤：

  1. 将细胞（2 × 10⁵）接种于12孔板，顺铂处理24小时。                                                                                                                                                                                        2. 加入100 nM TMRE染色液，避光孵育30分钟。                                                                                                                                                                                                3. PBS洗涤2次。                                                                                                                                                                                                                                                4. 使用流式细胞仪（BD Accuri™ C6）或共聚焦显微镜（Zeiss LSM800）检测荧光强度。

结果展示：

线粒体ROS检测

方法：

• 染料：MitoSOX™ Red Mitochondrial Superoxide Indicator（货号 M36008，品牌 Thermo Fisher Scientific）。

步骤：

1. 顺铂处理细胞24小时。2. 收集细胞，用HBSS缓冲液洗涤。3. 加入5 μM MitoSOX染料，37°C避光孵育10分钟。4. HBSS洗涤2次。5. 流式细胞仪（BD Accuri™ C6）检测红色荧光（激发/发射波长：510/580 nm）。

结果展示

• ROS水平以相对荧光强度表示（*P < 0.05）。

线粒体质量检测

方法：

• 染料：MitoTracker Green FM（货号 M7514，品牌 Invitrogen)）。

步骤：

1. 细胞用PBS重悬。2. 加入100 nM MitoTracker Green，37°C避光孵育30分钟。3. PBS洗涤2次。4. 流式细胞仪检测绿色荧光（激发/发射波长：490/516 nm）。

结果展示：

参考文献[4]:Zheng ZY, Yang PL, Li RY, et al. STAT3β disrupted mitochondrial electron transport chain enhances chemosensitivity by inducing pyroptosis in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Lett. 2021;522:171-183. doi:10.1016/j.canlet.2021.09.035

主营项目

1. 动物实验

动物饲养、疾病造模、行为学检测、心功能、无创血压、血常规、全自动生化检测等

2. 细胞实验

CCK8/MTT、原代细胞分离、流式细胞实验、细胞划痕、侵袭、迁移、EDU染色、转染、稳定株

3. 分子生物学

PCR检测、荧光定量PCR、绝对定量PCR、端粒酶长度、pull down、双荧光素酶、SSR、SNP检测等

4. 蛋白实验

WB、Co-IP、酵母双杂

5. 病理实验

HE染色、免疫组学、电镜

6. 生理生化实验

肝肾功能、抗氧化、免疫反应等生理免疫指标;动植物营养指标、微量元素、重金属、酶活等。

7. 多组学实验

基因组、转录调控、蛋白组、代谢组、微生物多样性、宏基因组、生信分析

8. 整体课题实验

方案设计、整体实验交付、标书写作、论文润色、协助投稿

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康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

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