今天给大家带来的这篇文章2023年5月发表在Cancer Cell上，论文标题为“Exhaustion-associated cholesterol deficiency dampens the cytotoxic arm of antitumor immunity”。中科院分子细胞科学卓越创新中心许琛琦团队与武汉大学生科院宋保亮院士团队合作，研究绘制了肿瘤微环境中胆固醇图谱，揭示胆固醇缺乏驱动肿瘤微环境中T细胞耗竭和功能障碍的机制。通过CRISPR-Cas9敲除CAR-T细胞的LXRβ，能够解除胆固醇缺乏导致的T细胞耗竭和功能障碍，从而显著增强CAR-T的肝癌治疗效果。

临床问题

肿瘤微环境（TME）中存在各类免疫细胞：肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）可以识别并杀伤肿瘤细胞；髓系细胞，主要是肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和中性粒细胞，行使肿瘤促进和免疫抑制功能。T淋巴细胞进入肿瘤微环境后可能会发生耗竭和失能，清除肿瘤能力减弱。目前研究发现造成T细胞耗竭和失能的原因有：其一是慢性抗原刺激，其二是肿瘤微环境引发T细胞代谢变化。

肿瘤微环境中的营养限制是导致肿瘤细胞免疫逃避的重要因素。葡萄糖是研究广泛的肿瘤微环境营养限制因素，其他必需营养素的重要性也在逐渐得到认识。胆固醇作为细胞膜结构（包括质膜）的重要组成部分，对细胞增殖至关重要。癌细胞通常通过激活SREBP2信号来上调胆固醇的生物合成和摄取，以获得足够的增殖基础。基于抑制胆固醇获取来抑制肿瘤细胞增殖这一理论，降胆固醇药物——他汀类药物，通过抑制胆固醇生物合成中的限速酶HMG-CoA还原酶，用于癌症治疗。

然而其实际益处并不大，因为肿瘤微环境中各类细胞的胆固醇水平、实际效应以及肿瘤细胞与免疫细胞是否存在胆固醇竞争仍未知，仅仅靶向肿瘤细胞降低其胆固醇水平容易忽视对其他类型细胞的影响。因此，需要仔细评估临床测试使用的靶向胆固醇代谢药物对不同类型免疫细胞有益或有害的作用。对此，我们仍需把目光放到肿瘤微环境全局而非仅局限于肿瘤细胞。

 小知识细胞的胆固醇代谢主要受两个关键转录因子SREBP2和LXR调控：SREBP2通过调控胆固醇生物合成和摄取基因来上调细胞胆固醇水平；LXR通过调控胆固醇外排和抑制胆固醇摄取基因来下调胆固醇水平。

研究内容

为了解肿瘤微环境中淋巴细胞胆固醇水平变化，以及尝试对其干预观察能否增强抗肿瘤功能，本篇文章对以下两个方面进行全面而详细的探究：查看肿瘤微环境的胆固醇图谱→ 锁定CD8+ T细胞会因胆固醇缺乏而丢失 → 了解CD8+ T细胞对胆固醇需求特性 → 胆固醇缺乏诱导CD8+ T细胞自噬介导的凋亡 →  TME中胆固醇缺乏引发T细胞耗竭机制 → LXR抑制的抗肿瘤作用
①肿瘤微环境的胆固醇图谱

在小鼠B16F10肿瘤和人肝癌肿瘤组织中，通过ALOD4-AF647染色测定质膜胆固醇水平，通过测量活细胞吸收荧光标记脂蛋白的能力测定不同细胞群的胆固醇摄取水平。发现肿瘤浸润淋巴细胞具有较低的胆固醇水平和胆固醇摄取能力。

进一步确认TILs低胆固醇水平的特殊表现，通过过继转移实验比较不同刺激对T细胞胆固醇水平的影响，发现肿瘤浸润性OT-I T细胞的胆固醇水平远低于疫苗激活的OT-I T细胞，甚至低于从未受活性抗原刺激的肿瘤小鼠分离的脾OT-I T细胞。这些数据共同表明，TME可以导致TILs中的胆固醇缺乏。

②胆固醇缺乏会导致肿瘤微环境中CD8+ T细胞丢失

使用ScapCKO小鼠模型-特异性从T细胞中去除SCAP（SREBP2的激活蛋白），抑制胆固醇的获取。移植MC38结直肠癌细胞后检测TME，发现CD8+ T细胞数量减少，CD4+ T细胞和Treg数量未受影响。对数量减少的PD-1+ CD8+ T 细胞类群进行RNA sequencing，发现细胞增殖分化相关通路、细胞周期通路表达下调。

③CD8+ T比CD4+ T细胞更积极参与胆固醇获取

两种细胞针对SCAP缺失的反应不一样，受影响更大的说明更依赖胆固醇。通过测量两种细胞的胆固醇代谢和相关通路：FCM +ALOD4探针测量PM cholesterol水平、扩张速率；[14C]acetate pulsing测胆固醇从头合成比例、脂蛋白摄取速率、胆固醇合成和摄取通路中关键蛋白的表达（SREBP2&LXR）、细胞核SREBP2水平、AKT和mTORC1通路水平、ACSS2胆固醇合成起始酶水平。发现CD8+T细胞摄取利用胆固醇更高，且验证了AKT-mTORC1-SREBP2信号通路在CD8+ T细胞中驱动更活跃的胆固醇获取，通路和胆固醇可以形成一个前馈回路。

④CD8+ T比CD4+ T细胞更易受胆固醇缺乏影响

基于两种细胞胆固醇代谢的不同，来查看在胆固醇缺乏时在细胞增殖和细胞存活方面的反应如何。通过基因干预（Scap KO、Ldlr KO）、药理干预（lovastatin→抑制近端酶 HMGCR / Ro 48-8071→抑制远端酶 OSC）发现，胆固醇缺乏对CD8+T的增殖抑制较强，并且导致更多细胞死亡。

⑤胆固醇缺乏诱导CD8+ T细胞自噬介导的凋亡

接下来查看CD8+ T细胞是何种死亡类型。胆固醇缺乏时，检测到了细胞凋亡、细胞自噬特征：capase3/PARP分裂、DNA碎片、核断裂；ULK1磷酸化降低、LC3b成熟；mTORC1不活跃。进行上游-添加胆固醇/下游-凋亡抑制剂和自噬抑制剂功能挽救实验发现，上游的功能挽救更有效：上游干预激活mTORC1，下游干预仅仅阻止caspase-8-caspase-3-PARP激活。比较两种细胞的自噬表型，CD8+ T细胞更显著。

到此为止，文章确认了TME中CD8+ T细胞胆固醇缺乏，了解CD8+ T细胞对胆固醇需求特性及缺乏后果。那么，在TME中CD8+ T细胞胆固醇缺乏的机制是什么呢？

⑥在耗竭T细胞中，SREBP2和LXR通路的发生改变

Ⅰ）确定引发T细胞内胆固醇水平改变的因素和相关通路

使用动物模型（Huh7异种移植瘤+GPC3.BBZ CAR-T过继移植）和细胞模型（Huh7和CAR-T细胞共培养），通过bulk RNA sequencing 和 RT-qRCR验证发现，SREBP2通路水平↓和LXR通路水平↑。由于甾醇代谢物如氧化甾醇可以直接调节SREBP2和LXR活性，甾醇组学来测量Huh7 细胞培养基中的甾醇代谢物发现，培养基含有的27-羟基胆固醇（27-HC）是LXR的一种强效激动剂，也可以与INSIG结合，抑制SREBP2的易位和激活。

Ⅱ）SREBP2/LXR信号通路和代谢途径的改变，驱动T细胞耗竭或功能障碍

使用SREBP2通路抑制剂 (lovastatin or Ro 48-8071)、LXR 通路激活剂 (LXR agonist RGX-104 or GW3965)均能抑制CAR-T细胞增殖，CAR-T细胞胆固醇缺乏模型+处理（与肿瘤细胞共培养+抑制剂/激活剂）下，进行bulk RNA seq，LXR↑&SREBP2↓通路改变下调了缺氧/糖酵解通路和mTORC1活性，上调了干扰素反应。缺氧反应促进CD8+ T细胞的抗肿瘤效应功能和组织驻留，胆固醇缺乏导致的缺氧反应下调会减弱抗肿瘤免疫并使T细胞在缺氧肿瘤微环境中易受攻击。糖酵解通路和mTORC1活性下调会抑制T细胞合成代谢与能量生成，影响细胞分化和存活。上调的干扰素反应会驱使T细胞耗竭，降低ICB疗效，并可能进一步下调T细胞胆固醇水平。

因此，氧甾醇介导的胆固醇水平下降驱使T细胞耗竭和功能失调，主要的代谢途径和信号通路被揭示。且与慢性抗原刺激导致T细胞耗竭的机制（转录因子TOX/SOX4）不同。

⑦LXRβ缺失促进肝癌模型中CAR-T细胞活性

LXR通路基因在耗竭的T细胞中表达改变极大，选中LXR抑制的策略。筛选出LXRβ，敲掉后体内外验证，并验证安全性。
总结

文章系统性地研究了肿瘤微环境中T淋巴细胞的胆固醇代谢状态，为进一步通过靶向胆固醇代谢治疗肿瘤提供了理论基础。除此之外，该研究可能也与其他涉及到T细胞胆固醇代谢的疾病相关。对于自身免疫和慢性炎症，过度活化的T细胞会导致组织损伤，抑制胆固醇获得可能通过抑制T细胞免疫来改善疾病进展。进一步的研究方向：

① 肿瘤微环境中其他免疫细胞类群的胆固醇水平以及对功能的影响；

② T细胞中胆固醇缺乏是如何导致干扰素反应上升的；

③ 只在肝癌模型中进行了胆固醇水平修正，在其他类型的癌症中有待考察；

④ 胆固醇生物合成途径的另一个产物-类异戊二烯的功能有待探究。

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动物饲养、疾病造模、行为学检测、心功能、无创血压、血常规、全自动生化检测等

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CCK8/MTT、原代细胞分离、流式细胞实验、细胞划痕、侵袭、迁移、EDU染色、转染、稳定株

3. 分子生物学

PCR检测、荧光定量PCR、绝对定量PCR、端粒酶长度、pull down、双荧光素酶、SSR、SNP检测等

4. 蛋白实验

WB、Co-IP、酵母双杂

5. 病理实验

HE染色、免疫组学、电镜

6. 生理生化实验

肝肾功能、抗氧化、免疫反应等生理免疫指标;动植物营养指标、微量元素、重金属、酶活等。

7. 多组学实验

基因组、转录调控、蛋白组、代谢组、微生物多样性、宏基因组、生信分析

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