蛋白质乙酰化修饰，顾名思义指的就是在蛋白质原有基础上面嫁接上乙酰化基团。在细胞中，乙酰化修饰的反应由乙酰基转移酶所催化，将乙酰辅酶A的乙酰基转移并添加在蛋白质赖氨酸残基上。在早期的研究中，乙酰化修饰一直被认为是真核细胞所特有的一种翻译后修饰，直到后来研究发现原核细胞中也存在着蛋白质乙酰化修饰。所以，乙酰化修饰是原核和真核生物所共有的一种翻译后修饰类型。

   蛋白的乙酰化修饰早在20世纪60年代就被发现了，但真正受到科学界“追捧”却是经历长达半个世纪的“辛酸”历程。1964年，乙酰化先驱 Vincent Allfrey 确定了组蛋白（histone）中的乙酰化，并提出了这种蛋白修饰在转录调控中可能有作用。同时期发现的磷酸化修饰自1959年确定后，即得到了飞速发展，而乙酰化修饰在发现后的30年间并未得到科学家的重视，直到近20年随着乙酰化相关酶以及非组蛋白乙酰化逐渐被“解锁”，乙酰化方面的文章数量呈井喷式增长。2006年，抗体富集和质谱技术被引入乙酰化相关研究，检测到的修饰蛋白数得到极大提升，乙酰化正式晋升为蛋白翻译后修饰研究的“当红小生”之一。

1.乙酰化

赖氨酸乙酰化是可逆的翻译后修饰，在调控蛋白质功能、染色质结构和基因表达中起重要作用。许多转录辅助活化因子都具有乙酰基转移酶内在活性，而转录辅助抑制因子则与去乙酰酶活性相关。作为对信号转导通路的响应，乙酰化复合体（例如 CBP/p300 和 PCAF）或去乙酰化复合体（例如 Sin3、NuRD、NcoR 和 SMRT）聚集成为结合 DNA 的转录因子 (TF)。组蛋白乙酰转移酶 (HAT) 作用下的组蛋白高度乙酰化与转录激活相关，而组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 作用下的组蛋白去乙酰化则与转录抑制相关。组蛋白乙酰化通过重构更高层级的染色质结构，弱化组蛋白与 DNA 之间的相互作用，以及为转录激活复合体提供结合位点来促进转录，转录激活复合体包括含有布罗莫结构域的蛋白质，该蛋白质能够结合乙酰化赖氨酸。组蛋白去乙酰化则通过相反的机制来抑制转录，这些机制包括高级染色质结构的组装，以及排除含有布罗莫结构域的转录激活复合体。组蛋白低乙酰化是异染色质沉默的标志。越来越多的非组蛋白的特定位点乙酰化已被证实可调节其活性、定位、特异性相互作用以及稳定性/降解。值得一提的是，最近质谱分析技术取得的进展实现以高分辨率对所有蛋白质组中的大多数乙酰化位点进行定位。这些研究显示“乙酰组”在大约 1750 个蛋白中包含近 3600 个乙酰化位点，表明乙酰化修饰是自然界最丰富的化学修饰之一。事实上，这一标志可能影响蛋白质各种不同生理过程的活动，包括染色质重构、细胞周期、剪接、核转运、线粒体生物学，以及肌动蛋白成核。在生物体方面，乙酰化对免疫、生理节律以及记忆的形成有重要作用。蛋白质乙酰化是众多疾病新药设计的有利靶标。

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HAT的发现

在1964年，ALLFREY发现组蛋白乙酰化修饰影响着基因的活性，但未找到乙酰化酶或去乙酰化酶。1995年时也曾发现一种酶在组蛋白进入细胞核以前使刚合成的组蛋白乙酰化，这种酶现称为细胞质乙酰基转移酶(HAM)。乙酰化酶通过传统的蛋白质分类方法是很难找到的。直到ALLIS和BROWNELL研究出了一种新的蛋白质分离方法，并以四膜虫的核提取物为实验对象，最终找到了乙酰化酶，并命名为histone acetyltransferase type A (HATA)，属于一类转移酶。此后就开始在基因库中寻找那些序列和HATA相似的基因。结果发现酵母基因Gcn5p与四膜虫的HATA非常相似，实验也证明Gcn5p在酵母中的作用就相当于HATA在四膜虫所起的作用。
 

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乙酰化酶的分类 

乙酰化酶（acetyltransferase），或称组蛋白乙酰转移酶（histoneacetyltransferase，HAT），是使组蛋白乙酰基化，减弱组蛋白与DNA的紧密结合能力，促进转录的酶。研究表明HAT活性异常可导致从神经性病变到癌症等多种疾病的发生。组蛋白乙酰转移酶（HAT）及组蛋白去乙酰化酶（HDAC）调节组蛋白和转录因子的乙酰化水平，从而在控制细胞生命活动中发挥着重要作用。

      根据HATs的来源和功能将其分为两类：A型位于细胞核内，与染色质上的组蛋白结合，主要乙酰化核小体组蛋白，也可使非组蛋白乙酰化，与基因转录相关；B型存在于细胞质，使细胞质中新合成的游离组蛋白乙酰化，利于其转运到细胞核中，因而对基因表达调控起重要作用的主要是A型HATs。研究发现，许多转录辅激活因子具有内源性的A型HATs活性。目前已被鉴定的HATs有二十多种，主要为如下几个家族：GNAT(Gcn5-related N-acetyltransferases)家族，其主要成员有Gcn5、PCAF、Elp3、Hatl、Hpa2等；MYST家族；P300／CBP家族；另外还有一些转录因子，如TAFII250；核受体辅激活物，如ACTR、SRCl等.（1）GNAT家族：GNAT家族(Gcn5-related N-acetyltransferases)是迄今了解的比较全面的一个超家族，它们是在若干同源区和乙酰化相关基序上相似的一类物质。包括Gcn5(general control nonderepressible-5’)，Elp3、Hatl、Hpa2，另外还包括其它的真核和原核不同底物的乙酰转移酶，显示出这类物质在进化的过程中的保守性和广泛性。在N末端到C末端的四个序列基序C，D，A，B的功能还不是很清楚，C基序存在于大多数GNAT家族乙酰转移酶，但是在多数已知的HAT上却没有。A基序是高度保守的区域，与MYST蛋白共有。此外，还包括一个Arg/Gln-X-X-Gly-X-Gly/Ala片断，可特异性识别结合乙酰辅酶A底物。（2）MYST家族：一组进化相关蛋白，主要成员有MOZ、Ybs2/Sas3、Sas2和Tip60，另有酵母Esal，果蝇MOF，人HB01和MORF。这组蛋白有着相似的片段和特异的乙酰转移酶同源区(部分基序A与GNAT共有)。（3）p300／CBP：p300／CBP是一个大约300kDa，2400个残基的大蛋白，它是一个无处不在的，通用的转录共活化物，在多种细胞过程中起着重要的作用，包括细胞的周期、分化、凋亡。p300和CBP的变异与特定的癌症和其它人类疾病过程相关。在分子水平上，p300／CBP是参与多种DNA转录因子调控的转录协同因子，通过和一些特定的转录因子(如CBEB、核激素受体、癌蛋白相关因子c-Fos，C-Jun，c-Myb)形成复合物，帮助启动特定基因的表达。（4）细胞核受体共活化物：激素信号也能激活HAT蛋白参与转录，因此，人类细胞核共活化物也是一类独特的HAT蛋白家族，包括SRC-1(steroidreceptorcoaetivator-1)、ACTR和TIF2。（5）TFIIIC：实验表明，组蛋白乙酰化转录中的功能亚单位TFIIIC，是RNA聚合酶Ⅲ的一个普通转录因子，近来被鉴定为HATs。其功能是通过结合启动DNA和招募TBP-TFⅢB、多聚酶RNA III启动转录复合物的形成。近期体内实验纯化得到人类TFⅢC显示了其潜在的HAT活性。可乙酰化H3、H4、H2A单体组蛋白和核小体。

2.去乙酰化

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)是一类蛋白酶,对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。一般情况下,组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。而组蛋白的去乙酰化则发挥相反的作用。

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去乙酰化酶的发现

HDACs最初在酿酒酵母中发现，后来相继在不同的生物中发现多种HDACs，它们具有不同的功能。

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去乙酰化酶的分类

至今已发现的人类HDACs有18种，根据其与酿酒酵母的三种HDACs(Rpd3、Hdal和Sir2)的同源性分为三类。第1类与与酵母的Rpd3同源，结构相近，包括HDACl、HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDACI1；第Ⅱ类与第I类有相近的催化活性。但二者在结构核功能上有明显的不同。第Ⅱ类与酵母Hdal有相近的催化结构，又可分为A亚类和B亚类，ⅡA类是转录共遏制因子(corepressor)，包括HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9，ⅡB类包括HDAC6、HDACl0。第Ⅲ类与酵母中的Sir2同源，已在人细胞中鉴定出7种，分别为SirTl-7。HDACs在真核细胞中相当保守。在HDAC／Rpd3家族中，各种酶的C末端均有3个区域含有高度保守的氨基酸残基(组氨酸、天冬氨酸、甘氨酸)，如果将HDACl的这3个区域中的天冬氨酸核组氨酸突变为天冬酰氨或丙氨酸，则去乙酰基作用会部分或完全消失，即上述这些区域可能是酶活性位点的组成部分。

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组蛋白乙酰化

细胞核中的染色体是高度压缩的，而折叠时DNA缠绕的就是组蛋白。


将组蛋白区域放大，我们就会看到这样一串念珠，组蛋白被一根DNA序列串起来。


为了方便研究，我们将一个组蛋白和其附近 147bp DNA片段，叫一个核小体。也就是说，核小体 = 组蛋白 + DNA(147bp)


把组蛋白拆开来，它其实有八个部分来构成：组蛋白八聚体 = 2个H2B + 2个H2A + 2个H3 + 2个H4


下面是检测到的组蛋白三维结构示意图，细心的你们一定会发现在每种组蛋白结构都会伸出来一小段“线头”，这是蛋白质的N端，也叫尾巴(tail)。

事实上，每个组蛋白结构都会延伸出这个“尾巴”，组蛋白修饰就是在这个尾巴上进行的。

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组蛋白乙酰化

组蛋白甲基化和乙酰化主要发生在它们的N-末端尾部并且可以影响基因的转录。组蛋白乙酰化主要与基因激活有关，组蛋白乙酰化主要发生在H3、H4的N端比较保守的赖氨酸位置上，是由组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶协调进行。特定基因区域的组蛋白乙酰化和去乙酰化是以一种非随机的、位置特异的方式进行。乙酰化可能通过对组蛋白电荷以及相互作用蛋白的影响，来调节基因转录

总结下，目前学到的组蛋白修饰及其作用：

这些组蛋白修饰也可以共同作用来完成调控，比如，H3K9ac也与H3K14ac和H3K4me3高度共存共同作为活性基因动子的标志。

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其他组蛋白乙酰化

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非组蛋白乙酰化

蛋白质乙酰化最早发现主要发生在细胞核内的组蛋白上，参与调控基因转录过程。后来，随着蛋白质谱灵敏度的增加，越来越多的非组蛋白被发现也会发生乙酰化修饰。蛋白乙酰化研究开始在代谢、免疫、细胞周期、DNA损伤修复、凋亡、自噬等领域如火如荼地展开。

一篇2019年末发表在Nature Communications上的自噬领域的研究论文为例简要剖析一下基本的研究思路。

目标蛋白是否存在乙酰化修饰？该论文研究的是自噬受体蛋白p62。为了确定p62是否存在乙酰化修饰，作者首先用了两种去乙酰化酶抑制剂TSA（HDAC家族抑制剂）和NAM（Sirtuin家族抑制剂），确定内源的p62和外源的p62在细胞中均可以发生乙酰化。
值得注意的是，只有TSA处理能够提高p62的乙酰化水平，这里就提示p62的去乙酰化过程由HDACs而非Sirtuins介导。

乙酰化水平受到怎样的调控？作者用了多种刺激处理细胞，包括饥饿和MG132（蛋白酶体抑制剂）等，发现只有饥饿能够显著提高p62的乙酰化水平。多说一句，有一位大牛这样讲过，不受调控的蛋白翻译后修饰都是耍流氓，可见找到蛋白翻译后修饰的调控模式多么重要。

确定乙酰化转移酶在哺乳动物细胞中，介导蛋白发生乙酰化修饰的主要包括p300、CBP、PCAF、GCN5和TIP60在内的5种乙酰化转移酶。一般只需要在细胞内进行简单的筛选，如在细胞内分别高表达或者敲除/低以上乙酰转移酶，检测目标蛋白的乙酰化水平，基本就可以确定目标蛋白的乙酰化由哪个乙酰转移酶介导。在这篇文章里，作者发现在细胞内高表达TIP60能够显著提高p62的乙酰化。

确定去乙酰化酶由于已经确定p62的去乙酰化过程由HDACs介导。因此作者就利用不同的HDAC在细胞内作了简单的筛选，发现在细胞内高表达HDAC6能够显著降低p62的乙酰化水平，也就表明p62的去乙酰化由HDAC6介导。作者进一步利用体外实验证明HDAC6可以直接去乙酰化p62。

确定乙酰化位点一般确定乙酰化位点有两种常用的方法：在细胞内直接纯化目标蛋白进行质谱鉴定；在体外利用纯化的目标蛋白与乙酰转移酶进行体外乙酰化反应，将反应后的目标蛋白进行质谱鉴定。无论哪种方法确定的乙酰化位点，都要通过构建突变体进行最后的确定。乙酰化主要发生在赖氨酸（K）上，一般而言，赖氨酸突变为精氨酸（R）相当于模拟去乙酰化，赖氨酸突变为谷氨酰胺（Q）相当于模拟乙酰化。
对目标蛋白的影响确定了乙酰化位点，一般就可以利用构建的模拟乙酰化/去乙酰化突变体研究乙酰化对于目标蛋白功能的影响。在这篇文章中，由于乙酰化位点主要发生在介导p62结合泛素的UBA结构域，因此作者就检测了乙酰化/去乙酰化突变体与泛素的结合情况，以及对UBA结构域形成二聚体影响。

生物学功能仅仅研究乙酰化修饰对于目标蛋白的影响还不够，一般还需要进一步在细胞水平或者动物水平研究目标蛋白乙酰化的生物学功能。由于p62主要作为自噬受体在自噬过程中发挥作用。作者因此检测了诱导自噬条件下细胞内泛素化蛋白的降解情况和对细胞活力的影响。
总结而言，蛋白的乙酰化修饰研究一般包括以下步骤：确定目标蛋白是否存在乙酰化；筛选乙酰化酶/去乙酰化酶；鉴定乙酰化位点；解析乙酰化对目标蛋白的影响；探究目标蛋白乙酰化的生物学功能。

5.总结

乙酰化是一个普遍而重要的蛋白质翻译后修饰，不仅集中在对细胞染色体结构的影响以及对核内转录调控因子的激活方面，而且还影响参与细胞周期和新陈代谢、肌动蛋白聚合控制、肿瘤及多聚谷氨酰胺疾病等方方面面。乙酰化不仅存在于真核细胞中，而且越来越多的证据也表明乙酰化同样影响许多原核细胞的生理生化过程。

早期的研究发现乙酰化主要发生在组蛋白赖氨酸位点上，但是随着后来的研究发现越来越多的非组蛋白的特定位点乙酰化也被证实可调节其活性、定位、特异性互作及蛋白质稳定性等。
除了赖氨酸可以发生乙酰化修饰外，也有研究发现存在着丝氨酸、苏氨酸的乙酰化修饰，并且丝氨酸和苏氨酸的乙酰化修饰与这些氨基酸的磷酸化修饰相互竞争，从而改变细胞的信号通路机制。这些研究发现说明了：赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸等氨基酸的乙酰化修饰可以与甲基化、泛素化、磷酸化、糖基化等翻译后修饰相互竞争，从而影响细胞信号通路机制。

由于质谱技术的进展以及与生物学的联合，得以实现了对所有蛋白中的大所数乙酰化位点进行定位。这些研究显示「乙酰组」在大约 1750 个蛋白中包含近 3600 个乙酰化位点，表明乙酰化修饰是自然界最丰富的化学修饰之一，这也表明了乙酰化可能影响蛋白质的各种不同的生理活动过程，蛋白质乙酰化也是近年来众多疾病新药开发设计的有利靶标。

参考文献：

1. 组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶的研究，LV Lin等.

2. 知乎，酸菜/白墨.

3. CST信号通路简介.

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