对肿瘤的研究，主要包括功能研究和机制研究，细胞功能的研究主要是体现肿瘤生物学特性。其中肿瘤细胞的迁移、侵袭功能研究是必不可少的，肿瘤细胞的迁移侵袭能力的研究，也为后续信号通路、功能机制研究打下基础。  Transwell 迁移、侵袭实验主要用于检测肿瘤细胞体外的迁移、侵袭能力，由此可见，做好Transwell迁移侵袭实验是至关重要的。

1.实验原理  

      将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
      应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。侵袭实验中使用到的Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。
      Transwell小室的滤膜孔径一般为8μm，在侵袭实验中，膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

2. 材料与试剂

ØTranswell小室

Ø细胞生长培养基

Ø胎牛血清

Ø胰蛋白酶

ØPBSØ青霉素-链霉素溶液（100×）

Ø结晶紫或台盼蓝

Ø4%多聚甲醛ØMatrigel（侵袭实验）

3. 实验步骤

1、实验前一天，将已经分装后的一管Matrigel基质胶从-20℃提前放入4℃冰箱过夜，Matrigel胶即从固体状态融化为液体状态。Matrigel基质胶以1：8稀释后包被transwell小室底部膜的上室面(整个过程注意冰上操作，否则Matrigel在10℃以上即会凝固)，3小时风干。注：如进行迁移实验，则跳过这一步骤。
　　2、水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50μL 10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。
　　3、常规胰酶消化细胞，PBS洗1-2遍去除血清的影响，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为5*105个/mL。
　　4、取200μL细胞悬液加入Transwell小室上室， 24孔培养板下室内加入600μL 含10% FBS培养基。注意下层培养液与小室之间不要产生气泡。
　　5、培养板置于37℃的CO2培养箱中，依据肿瘤细胞侵袭能力而定培养12-48h。
　　6、取出小室，PBS淋洗2遍，用棉签小心擦去小室微孔膜上层内的细胞，在24孔板内4%多聚甲醛(或95%酒精)固定20 min，结晶紫溶液染色15 min。
　　7、倒置显微镜下拍照，每个样本随机计数10个视野，取平均值，统计分析。

4. 实验结果

拍照结果呈现

5.注意事项

1、细胞接种剂量不同的细胞，其侵袭能力是不同的，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，最后会难以统计结果;而细胞量过少，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，进入下室。因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。

几种常见细胞的每孔接种数量如下表：(个人经验，不同实验室可能略有差异)　

2、避免产生气泡下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，将小室放入培养板时要注意，如有气泡产生，须将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。　　3、检测时间点培养时间主要依癌细胞侵袭能力而定，时间点的选择除了要考虑到细胞、细胞侵袭力及处理因素等。　　4、注意事项用棉签擦掉上室细胞时注意不要蹭到已穿膜的那一层细胞。　　5、对于比较难穿膜的细胞，可以在实验开展前撤掉血清，饥饿处理12h-24h。

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