大小鼠胰腺炎模型

小伙伴们，大家好，今天我们将通过一篇文章来了解大小鼠的胰腺炎模型，本文发表在2024年1区Top医学期刊《Gut》上，影响因子为23。标题为“Pancreas-directed AAV8-hSPINK1 gene therapy safely and effectively protects against pancreatitis in mice”。

文章讨论是一种基于腺相关病毒（AAV8）介导的人类SPINK1基因（hSPINK1），在感染小鼠的胰腺转导效率和安全性，以及三种小鼠模型（雨蛙素诱导、胰管结扎和Spink1 C .194+2T>C小鼠模型）中预防和治疗胰腺炎的效果。

一、

研究背景

慢性胰腺炎（CP）是一种由遗传和环境因素引起的终身进行性纤维炎性疾病。其特征是腹痛，急性胰腺炎（AP）反复发作，胰腺功能随时间推移而恶化，导致患者生活质量显著降低。CP的患病率从每10万人13.5例到52.4例不等，并且在过去二十年中稳步增加，造成了很高的疾病负担。CP也显著增加胰腺癌的风险。不幸的是，目前还没有根治CP的方法，迫切需要有效的治疗和疾病预防策略。

二、

模型构建

文献中使用的造模方法：

1. 雨蛙素诱导

①以每隔1 h腹腔注射7次雨蛙素（100 μ g/kg体重），建立雨蛙素诱导的AP小鼠模型。

②通过反复发作AP，建立雨蛙素诱导的CP模型，小鼠按体重50 μ g/kg/小时腹腔注射雨蛙素6次。每次注射间隔1小时，每周3天，共连续4周。

2. 胆管结扎

①结扎诱导AP模型，结扎连接十二指肠的胆胰总管，结扎后24小时取组织标本。

②结扎胃和十二指肠叶交界处胰管诱导CP模型，结扎28天后处死小鼠。

3. Spink1 C .194+2T>C小鼠模型

利用CRISPR/Cas9系统构建Spink1 C .194+2T>C突变小鼠模型。使用引物小鼠Spink1-F 5‘-TACTCAGCTTTTCTGAT TTCAGGGC-3’和小鼠Spink1-R 5‘-GCTAATGAGAGGGTGCATTAGAACA TG-3’对小鼠基因型进行Sanger DNA测序验证。考虑到一些杂合子（Spink1+/−）小鼠在14周时发生自发性胰腺损伤，我们用AAV8-hSPINK1载体或无病毒对照治疗10周龄小鼠。在14周龄时收获小鼠，无论是否诱导AP。

*补充造模方法：

1. L-精氨酸（L-Arginine）腹腔注射法

L-Arg诱导AP动物模型，通常剂量为250-500mg/100g。L-Arg的作用呈剂量和时间依赖性，单次注射L-Arg 500mg/100g，70-80%胰腺腺泡细胞在3d内坏死，3次注射L-Arg 250mg/100g超过10d，近90%的腺泡被破坏。

造模方法：大鼠：1次腹腔内给药1g/kg；小鼠：腹腔注射8% L -Arg 4 g/kg，连续2次，间隔1h。

2. 牛磺胆酸钠（Sodium Taurocholate, NaT）逆行胰胆管注射法‌

‌操作流程‌：麻醉小鼠后开腹，穿刺胆胰管并注射2-3%牛磺胆酸钠溶液（30-50 μL，10 μL/min），夹闭肝门胆管5分钟促进溶液扩散‌。

‌病理特征：24小时内胰腺出血坏死，伴腹腔皂化斑形成，模拟急性坏死性胰腺炎（ANP）‌。

3. 乙硫氨酸缺乏胆碱饲料法

‌操作流程‌：饲喂含0.5% DL-乙硫氨酸的无胆碱饲料，连续6天‌。

‌病理特征‌：胰腺腺泡萎缩，纤维化增生，适用于慢性胰腺炎研究‌。

三、

文献解读

1. AAV8 -hSPINK1是一种安全的胰腺表达载体，在正常小鼠中具有高转导效率和强表达能力

为了分析这种衣壳优化的AAV8载体的体内转导效率，作者将生理盐水和四种不同剂量的载体（1×1011至5×1011 vg/只）腹腔注射给8周龄小鼠（每组n=3）。mNeonGreen表达的荧光显微镜显示，AAV8载体的最佳转导效率为2 ×1011 vg/只（图1A）。

为研究安全性，作者测试了这种修饰的载体是否对胰腺或其他重要器官有任何毒性作用。在理想的载体剂量（2 ×1011 vg/只动物）下，衣壳优化的AAV8载体特异性靶向胰腺，对心脏、肺、脾、肝和肾的器官趋向性较低（图1B）。并进一步评估了给药不同剂量AAV8载体的小鼠肝肾功能的血清指标，结果显示肝肾功能指标均在正常范围内（图1C）。

图一

这些小鼠在治疗2周到8周后，胰腺中RNA和蛋白质水平上的绿色荧光和hSPINK1表达都很强劲，在第4周达到峰值（被认为是最佳表达时间）（图2A - c）。这种表达在12周后仍然可以检测到。重要的是，在给药AAV8-hSPINK1后的8周内，对肝肾功能或胰腺指标没有显著影响。

图二

此外作者用小鼠胰腺裂解物中约50µg的总蛋白进行了定量western blotting，并通过胰蛋白酶对牛胰蛋白酶的抑制活性测定，测量了胰腺匀浆中SPINK1的总活性，还在注射后4周对生理盐水处理和AAV8-hSPINK1处理的小鼠进行了胰腺RNA- seq分析，总之，这些发现支持单剂量AAV8- - hSPINK1基因在体内的安全性和稳健性表达。

2.  AAV8-hSPINK1可减轻雨蛙素诱导的AP发作和严重程度，加速胰腺恢复

为了评估胰腺损伤的程度，通过末端转移酶介导的dutpnick末端标记（TUNEL）染色和cleaved caspase-3免疫荧光来评估胰腺凋亡。结果显示，与雨蛙素刺激对照组相比，AAV8-hspink1组阳性细胞数量较低（图3E）。通过透射电子显微镜（TEM）观察到，在雨蛙素处理的对照组胰腺腺泡细胞中，广泛的内质网扩张，酶原颗粒和含有细胞器的自噬液泡增加。

相比之下，在AAV8-hspink1组中很少观察到这些明显的病理改变（图3E）。为了进一步评估自噬水平，作者采用免疫荧光法研究了自噬的标志——微管相关蛋白1轻链3 β (LC3B)的表达。34结果显示，与对照组相比，AAV8-hspink1组LC3B水平明显降低（图3F）。

图三

与无病毒对照组相比，包括胰腺/体重、胰腺组织学变化和血清淀粉酶水平在内的多项参数一致表明，注射后2周至8周，AAV8-hspink1治疗持续减轻雨蛙素诱导的胰腺炎（在线补充图6）。且AAV8-hspink1组即使在高剂量下也能显著缓解雨蛙素刺激的胰腺炎。

3. AAV8 -hSPINK1可改善雨蛙素诱导的CP

在无病毒对照组和AAV8对照组中，胰腺-体重比均显著下降，胰腺切片显示结构异常，腺体广泛萎缩和炎症浸润（图4B）。天狼星红染色显示间质弥漫性纤维化，α-平滑肌肌动蛋白表达增加；细胞角蛋白19 （CK-19）水平升高（图4C，D，在线补充图6A）表明，腺泡-到-导管化生（ADM）很明显。然而，AAV8-hspink1处理组胰腺表现出较不明显的形态学异常（图4B-D）， CD45-阳性和F4/80-阳性细胞的胰腺浸润较少，血清炎症因子水平较低（在线补充图5C，D）。且在AAV8-hSPINK1组中，胰腺明显快速恢复，胰腺/体重、组织学变化和血清淀粉酶水平分别在24、48和12小时内恢复正常（在线补充图8）。总之，这些研究结果表明，AAV8介导的hSPINK1在胰腺中的表达可以显著改善细小蛋白诱导的AP至少8周，预防严重AP并促进胰腺快速恢复。

图四

4. AAV8-hSPINK1可减轻胰管结扎模型的炎症和纤维化

与AAV8-hSPINK1-处理小鼠相比，无病毒对照组的胰腺显示出严重的宏观水肿和出血（图5B，在线补充图10）。无病毒对照组胰腺间质和腺泡间水肿广泛，腺泡细胞大量坏死，炎症细胞浸润明显；相比之下，AAV8-hSPINK1治疗显著降低了胰腺组织组织学评分和炎症细胞浸润（图5C，在线补充图11A）。与无病毒对照小鼠相比，AAV8-hSPINK1处理小鼠的组织学评分较低，与血清炎症因子和淀粉酶水平改善以及细胞凋亡和自噬标志物表达水平降低相关（图5D，E，在线补充图11B）。

图五

作者进一步通过部分结扎胰管28构建CP模型，以模拟临床所见的胰总管结石梗阻。所有动物都能耐受手术并恢复良好。假手术或结扎术后4周摘取胰腺（每组n=4）（图6A）。无病毒对照组胰腺明显萎缩：H&E染色显示胰腺腺泡细胞大量丢失，脂肪沉积（图6B）；Sirius Red染色及免疫组化分析显示，部分胰管结扎导致胰腺纤维化和坏死增加，与细胞凋亡和自噬水平升高相关（图6C、D，在线补充图11C）。

然而，与无病毒对照组相比，AAV8-hSPINK1治疗显著降低了所有纤维化和炎症标志物，以及细胞凋亡和自噬水平。这些结果表明，在遗传水平上过表达hSPINK1可以阻止导管阻塞诱导的AP和CP的进展。

图六

5.AAV8-hSPINK1载体可改善spink1 c .194+2T>C突变小鼠胰腺病理改变，降低胰腺炎易感性

H&E和Sirius Red染色均显示治疗小鼠无自发性胰腺损伤表型（0.0%,0/12）（图7A，B，在线补充图12A）。此外，透射电镜显示，未处理的Spink1+/−小鼠在出生后14周的胰腺腺泡细胞发生了明显的超微结构改变，包括“轮状体”形成的内质网和频繁的酶原颗粒；而用aav8 - hspink1载体处理的Spink1+/ -小鼠内质网略微扩张，酶原颗粒较少（在线补充图12B）。

因此=AAV8-hSPINK1可减轻Spink1+/−小鼠的自发性胰腺损伤。此外，作者给Spink1+/−小鼠注射浓度为100和50 μg/kg的雨蛙素（每组n=3）。AAV8-hSPINK1处理的spink1 +/−小鼠在注射后4周表现出相对正常的胰腺表型，而未处理的Spink1+/−小鼠对100和50 μg/kg的雨蛙素刺激都很敏感，导致显著的胰腺水肿和腺泡细胞死亡（图7C，D）。

图七

四、

结论

综上所述，本工作首次证明了AAV8-hSPINK1介导的基因治疗胰腺炎具有较高的转导效率和安全性。该疗法的有效性已在多种胰腺炎小鼠模型中得到证实，为基因治疗策略成功治疗临床胰腺炎提供了临床前实验证据。进一步探索AAV8-hSPINK1在大型动物和非人类灵长类动物模型中的可行性和有效性是必要的。

主营项目

1. 动物实验

动物饲养、疾病造模、行为学检测、心功能、无创血压、血常规、全自动生化检测等

2. 细胞实验

CCK8/MTT、原代细胞分离、流式细胞实验、细胞划痕、侵袭、迁移、EDU染色、转染、稳定株

3. 分子生物学

PCR检测、荧光定量PCR、绝对定量PCR、端粒酶长度、pull down、双荧光素酶、SSR、SNP检测等

4. 蛋白实验

WB、Co-IP、酵母双杂

5. 病理实验

HE染色、免疫组学、电镜

6. 生理生化实验

肝肾功能、抗氧化、免疫反应等生理免疫指标;动植物营养指标、微量元素、重金属、酶活等。

7. 多组学实验

基因组、转录调控、蛋白组、代谢组、微生物多样性、宏基因组、生信分析

8. 整体课题实验

方案设计、整体实验交付、标书写作、论文润色、协助投稿

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康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

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