亲爱的小伙伴们，你们最近科研进展的还顺利吗？最近看到一个新闻非常气愤，广东工业大学有两研究生，他们暑假留校参与课题科研工作，但因为午休时间打游戏看视频娱乐被严厉地处罚。真的是没有天理了啊，午休时间都不能让人休息。还是建议各位小伙伴们要适当的娱乐休息，这样才能更好地投入科研事业！接下来给大家推荐一篇思路绝佳的文章，它将细胞焦亡、炎症小体、乙酰化和类器官结合在一起，快来看一下吧~

1.多种方法进行验证：研究使用各种技术评估了用抗肿瘤药物治疗的CRC细胞中的细胞焦亡，包括蛋白质印迹、乳酸脱氢酶释放试验和显微镜分析。为了揭示调节NLRP3的表观遗传机制，使用转座酶可及染色质测定法和RNA测序评估了染色质变化和NLRP3启动子组蛋白修饰。染色质免疫沉淀定量聚合酶链反应用于研究NLRP3转录调控机制。此外，还构建异种移植和患者来源的异种移植模型来验证药物组合的效果。

2.具有临床意义：研究揭示了HDAC2在抑制NLRP3/GSDMD介导的CRC细胞焦亡中起着至关重要的作用，并强调HDAC2是抗肿瘤治疗的潜在治疗靶点。

题目：抑制HDAC2可促进NLRP3/GSDMD介导的结肠直肠癌细胞焦亡，从而增强抗肿瘤治疗的敏感性杂志：Clinical and Translational Medicine影响因子：IF=7.9发表时间：2024年6月研究背景结直肠癌(CRC)占全球癌症发病率和死亡率的10%左右。大约一半被诊断患有CRC的患者最终会发展为转移性结直肠癌(mCRC)，主要治疗方式是化疗和靶向治疗。目前大量研究表明激活的细胞焦亡可以增强多种肿瘤的抗肿瘤治疗效果，但结直肠癌（CRC）中细胞焦亡的具体机制仍不清楚。
研究思路   

研究结果1.CRC中NLRP3沉默抑制了抗肿瘤治疗期间GSDMD介导的细胞焦亡免疫组织化学分析显示，与相应的相邻正常对照相比，CRC组织中的NLRP3表达显着降低，而GSDMD表达保持不变（图1A、B）。mRNA和蛋白质水平显示，NLRP3表达在原发性CRC组织中降低（图1C）。同样，观察到NLRP3在大多数CRC细胞系中被沉默，而GSDMD则广泛表达（图1D）。研究选择了四种具有差异NLRP3表达的CRC细胞系来测试药物诱导的细胞焦亡：NLRP3表达相对较高的HCT116和DLD1，以及表达相对较低的SW620和LS174T（图1D）。

Western blot分析显示，NLRP3沉默抑制了细胞焦亡途径的激活：Caspase1、GSDMD cleavage和Pro IL1β/IL-18释放减少（图1E）。经过36小时的瑞戈非尼或5-FU处理后，超过30%的NLRP3高表达肿瘤细胞表现出明显的焦亡形态，包括核固缩、细胞肿胀和膜起泡，而只有约2%的NLRP3低表达细胞表现出类似的形态变化（图1F）。

通过在流式细胞术分析中进行Caspase-1/PI双重染色，与NLRP3表达低的细胞相比，使用瑞戈非尼或5-FU在表达高水平NLRP3的细胞中诱导的焦亡百分比（Caspase-1+/PI+）明显更高（图1G、H）。NLRP3高表达肿瘤细胞表现出比NLRP3低表达细胞明显更高的LDH释放，这表明高水平的NLRP3导致细胞膜损伤增加（图1I）。综上所述，这些结果表明，沉默NLRP3会损害CRC细胞的细胞焦亡。  

 图1：结直肠癌(CRC)中NLRP3表达的缺失限制了抗肿瘤治疗期间gasdermin D(GSDMD)介导的细胞焦亡2.在CRC细胞中补充NLRP3表达可在体内和体外挽救GSDMD介导的细胞焦亡与野生型细胞相比，NLRP3过表达不会影响细胞焦亡标志物GSDMD、Pro IL-1β、Pro IL-18和Caspase-1的裂解，但在使用瑞戈非尼或5-FU等各种化疗药物治疗后观察到显着增加（图2A）。    

此外，与对照组相比，NLRP3过表达增强了多种药物诱导的LDH释放，并降低了CRC细胞的细胞活力（图2B、C）。使用高分辨率扫描电子显微镜分析受损的NLRP3过表达细胞，超微结构膜突起更明显（图2D、E）。Caspase-1/PI流式细胞术测定，与对照组相比，NLRP3过表达细胞中的细胞凋亡百分比(Caspase-1+/PI+)显著增加(图2F，G)。通过皮下注射NLRP3过表达的SW620细胞，构建异种移肿瘤模型。与对照异种移植相比，在12天的时间内，NLRP3过表达的肿瘤在接受瑞戈非尼或5-FU治疗后显示出肿瘤生长减弱，最终肿瘤负担减轻（图2H、I）。
免疫组织化学(IHC)和蛋白质印迹分析表明，与对照肿瘤相比，持续给药后，肿瘤内细胞焦亡相关标志物(Cleaved caspase-1和Cleaved GSDMD)的水平升高(图2J)。综上所述，NLRP3重新表达促进CRC细胞的细胞焦亡。   

 图2：在结直肠癌(CRC)细胞中补充NLRP3表达可在体内和体外挽救Gasdermin D (GSDMD)介导的细胞焦亡3.HDAC2介导的组蛋白去乙酰化导致CRC中NLRP3的表观遗传沉默表观遗传药物的筛选表明SAHA和VPA是CRC细胞中NLRP3的强效诱导剂，可显著提高转录本和蛋白质表达（图3A-C）。SAHA和VPA剂量依赖性地提高了四种结肠癌细胞系中的NLRP3水平（图3D、E）。
Spearman相关系数分析揭示了NLRP3与大多数HDAC之间存在负相关性。同时，这些去乙酰化酶的siRNA筛选表明，只有HDAC2敲低才会增加CRC细胞中的NLRP3转录（图3F）。
免疫印迹结果表明，相对于正常邻近组织，患者来源的CRC组织表现出较高的HDAC2蛋白丰度，这与NLRP3水平呈负相关（图3G）。此外，CRC细胞系的蛋白质印迹分析证实了HDAC2和NLRP3表达呈反比（图3H）。
TCGA数据分析显示，与正常样本相比，CRC样本中的HDAC2表达上调（图3I）。值得注意的是，用选择性HDAC2抑制剂SCA治疗可诱导结肠癌细胞中NLRP3水平的剂量依赖性上调（图3J）。与非靶向siNC转染相比，siHDAC2转染显著提高了NLRP3的蛋白质水平（图3K）。这些结果表明，CRC中HDAC2异常高表达导致NLRP3的表观遗传沉默。 

 图3：HDAC2介导的组蛋白去乙酰化导致结直肠癌(CRC)中NLRP3的表观遗传沉默4.敲除HDAC2可通过上调NLRP3激活GSDMD介导的细胞焦亡蛋白质印迹分析证实，HDAC2缺失导致GSDMD和IL1β裂解（图4A）。然而，在HDAC2缺陷细胞中敲低NLRP3会减弱这些蛋白质的裂解(图4B)。与对照细胞相比，HDAC2 KO细胞中的LDH水平升高，并且也可以通过敲低NLRP3来逆转这一现象(图4C、D)。使用具有不同HDAC2表达水平的PDO培养物进行了实验。暴露于瑞戈非尼后，与具有较高HDAC2表达水平(PDO-1)的类器官相比，具有较低HDAC2表达水平(PDO-2)的类器官表现出更明显的形态破坏(图4E)。
光学显微镜显示，约30%-40%的HDAC2 KO结肠癌细胞在药物治疗后表现出焦亡形态（特征性细胞膜膨胀），而野生型细胞仅有3%-6%出现焦亡形态（图4F）。然而，在HDAC2 KO系中通过siRNA介导敲低NLRP3可显著降低焦亡细胞比例至10%以下（图4G）。    研究进行了Caspase-1和PI双染。结果显示，在HDAC2 KO后，瑞戈非尼或5-FU诱导的细胞焦亡水平增加，而在NLRP3敲低（siNLRP3）后，细胞焦亡水平降低（图4H、I）。总之，结果确定了NLRP3是HDAC2的一个重要功能靶点，并证实HDAC2通过调节NLRP3水平来控制结直肠癌的药理学细胞焦亡。   

 图4：敲除HDAC2可通过上调NLRP3来激活gasdermin D(GSDMD)介导的细胞焦亡5.HDAC2通过抑制染色质可及性来阻断p-P65对NLRP3的转录作用热图显示，HDAC2沉默并未显著改变SW620细胞中的整体染色质可及性（图5A）。对按HDAC2 KO后染色质可及性变化排序的基因进行GSEA。结果表明，焦亡途径显著富集，排名第一（图5B）。染色质可及性变化的可视化显示开放染色质结构增强，特别是在NLRP3启动子处，而其他焦亡基因GSDMD、Caspase-1和PYCARD的调控区没有类似的影响（图5C）。之前的研究表明，瑞格非尼通过抑制GSK3β（Ser9）自磷酸化而显着增加p-P65（Ser536）的激活（图5D）。在检查NLRP3启动子的DNA序列后，确定了转录因子P65的假定结合位点，该位点位于NLRP3转录起始位点上游−1086至−1077bp(GGGAATTTCC)处(5E)。随后的ChIP测定表明，在HDAC2 KO或用HDAC2特异性抑制剂SCA治疗后，转录因子pP65与NLRP3启动子区域的结合增强(图5F)。
Western blot分析显示，用瑞戈非尼处理的HDAC2 KO细胞中NLRP3水平显著增加(图5G)。这些结果表明，HDAC2 KO提高了NLRP3启动子处的染色质可及性，从而允许在药物诱导条件下募集更多的p-P65，促进NLRP3转录激活。   

 图5：HDAC2通过抑制染色质可及性来阻断p-P65对NLRP3的转录作用6.抑制HDAC2可促进H3K27ac-BRD4-p-P65复合物的形成，从而激活NLRP3转录通过分析ChIP-seq数据集，与THP-1细胞和结肠隐窝细胞相比，CRC细胞中NLRP3启动子区域内的H3K27乙酰化水平明显较低（图6A）。ChIP表明，在HDAC2缺失后，NLRP3基因启动子处的H3K27ac增加，但H3K9ac没有增加（图6B）。
Western blot分析表明，与对照相比，HDAC2 KO细胞中的H3K27ac水平增加，NLRP3表达也相应增加（图6C）。
荧光显微镜分析显示，与野生型对照相比，瑞戈非尼治疗后，HDAC2 KO细胞中的核H3K27乙酰化增加，并且HDAC2 KO细胞中的p-P65核募集增强（图6D、E）。在细胞中进行免疫共沉淀实验，观察到内源性BRD4与P65和H3K27ac形成NLRP3复合物，在HDAC2 KO时该复合物得到增强（图6F）。此外，使用p-P65抗体的ChIP表明，在HDAC2 KO CRC细胞中，BRD4 siRNA处理抑制后，NLRP3启动子上的p-P65占有率降低（图6G）。结果表明，HDAC2缺失增加了H3K27ac，促进了H3K27ac-BRD4-p-P65复合物的形成，从而招募更多的p-P65并驱动NLRP3转录激活。 

 图6：抑制HDAC2可促进H3K27ac-BRD4-p-P65复合物的形成，从而激活NLRP3转录7.HDAC2与H3K27ac/p-P65/NLRP3相关，可预测预后并代表CRC的一个有希望的靶点研究构建CRC PDX 模型，使用蛋白质印迹法分析肿瘤裂解物显示，联合治疗组的Cleaved GSDMD升高，表明细胞焦亡，但两种PDX模型的单药组均未升高（图7A、B）。与对照组相比，瑞戈非尼加SCA组的肿瘤大小显着减小。然而，瑞戈非尼和SCA单独使用均未在体内显著抑制肿瘤生长（图7C、D）。在BP0036模型中，经过相同药物剂量治疗12天后，瑞戈非尼加SCA组的肿瘤生长抑制率明显高于单独使用瑞戈非尼治疗组（图7E）。在SW620结肠癌异种移植中也得到验证，联合治疗比单一治疗具有更佳的肿瘤抑制效果（图7F-H）。通过免疫组织化学染色分析了82例CRC患者标本中HDAC2、NLRP3、H3K27ac和pP65的表达水平，观察到HDAC2的表达与p-P65、H3K27ac和NLRP3的水平呈负相关（图7I）。Kaplan-Meier生存分析表明，HDAC2表达高的患者总体生存期较短（图7J）。    

图7：HDAC2与H3K27ac/p-P65/NLRP3相关，可预测预后并代表结直肠癌(CRC)的一个有希望的靶点
文章小结本研究表明CRC中HDAC2的过度表达导致NLRP3的表观遗传抑制，阻碍药物治疗引起的细胞焦亡。抑制HDAC2有助于形成H3K27ac-BRD4-p-P65复合物，从而促进NLRP3转录。这篇文章值得细细品味，除了“细胞焦亡”和“炎症小体”国自然热点，还有“乙酰化”和“类器官”，学会这篇文章的研究思路，分分钟中标~

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