一、酵母双杂交

酵母双杂交实验是一种经典的分子生物学技术，广泛用于研究蛋白质之间的相互作用。本实验旨在通过酵母双杂交系统验证NF-YC9蛋白与BIN2蛋白之间是否存在相互作用。实验设计包括以下几部分：

1. 实验材料与培养基

培养基：

二缺板（SD/-Trp/-Leu）：用于初步筛选融合蛋白的表达情况，同时排除单个融合蛋白的自激活现象。

四缺板（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）：用于进一步验证蛋白质之间的相互作用，通过检测报告基因（如HIS3和ADE2）的表达来判断互作的强度和可靠性。

2. 实验分组

①实验组：本实验的核心目标是验证NF-YC9与BIN2蛋白之间是否存在相互作用。通过将NF-YC9和BIN2分别构建到酵母双杂交系统的两个融合蛋白载体中，观察其在酵母细胞中的互作情况。

②阴性对照：设置阴性对照组，以确保实验结果的可靠性。阴性对照组中，两个融合蛋白之间不存在已知的相互作用，用于排除背景信号和非特异性结合的可能性。

阳性对照：选用已知存在相互作用的蛋白对（如BZR1与BIN2）作为阳性对照，以验证实验系统的有效性和可靠性。阳性对照组的预期结果为在四缺板上能够正常生长，且生长情况良好。

3. 实验结果分析

在实验过程中，我们分别将实验组、阴性对照组和阳性对照组的酵母菌株接种到二缺板（SD/-Trp/-Leu）和四缺板（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）上进行培养。经过一段时间的培养后，观察菌落的生长情况。

①二缺板（SD/-Trp/-Leu）：在二缺板上，实验组、阴性对照组和阳性对照组均能够正常生长，说明构建的融合蛋白载体在酵母细胞中成功表达，且酵母细胞能够正常生长和代谢。

②四缺板（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）：在四缺板上，阳性对照组的酵母菌落生长良好，说明已知的蛋白对（BZR1与BIN2）之间存在明确的相互作用，且实验系统运行正常。阴性对照组的酵母菌落未能生长，表明实验系统能够有效区分非特异性结合和背景信号。而实验组的酵母菌落也在四缺板上生长，且生长情况与阳性对照组相似。

二、pull-down

Western Blot 检测

以 GST-BIN2 作为诱饵时：在 Western Blot 检测中，可以清晰地检测到 His-NF-YC9 蛋白的特异性条带。这表明 GST-BIN2 诱饵蛋白能够成功捕获 His-NF-YC9 猎物蛋白，说明两者之间存在相互作用。

以 GST 作为诱饵时：在 Western Blot 检测中，未检测到 His-NF-YC9 蛋白的特异性条带。这表明 GST 诱饵蛋白无法捕获 His-NF-YC9 猎物蛋白，说明 GST-BIN2 与 His-NF-YC9 的相互作用具有特异性，而非由于非特异性结合导致。

三、BiFC

1、实验组：在实验组中，观察到明显的 YFP 荧光信号，表明 GST-BIN2-N-YFP 和 His-NF-YC9-C-YFP 融合蛋白之间发生了相互作用，导致 YFP 的两个片段重新组装并恢复荧光。

2、阴性对照组：在阴性对照组中，未观察到 YFP 荧光信号，说明 GST 蛋白与 His-NF-YC9 蛋白之间不存在相互作用，验证了实验系统的特异性。

3、共定位分析：在图像叠加（Merge）分析中，YFP 荧光信号与核定位标记蛋白 VirD2NLS-mCherry 的红色荧光信号有明显的共定位现象。这表明 GST-BIN2 与 His-NF-YC9 的相互作用发生在细胞核内。

四、CO-IP

1、实验组：在 Western Blotting 图像中，清晰地检测到 BIN2-MYC 和 NF-YC9-FLAG 的特异性条带。这表明在细胞环境中，BIN2-MYC 与 NF-YC9-FLAG 蛋白能够形成稳定的复合物，且两者之间存在体内相互作用。

2、阴性对照组：在阴性对照组中，未检测到 NF-YC9-FLAG 的特异性条带，仅检测到少量的非特异性背景信号。这表明实验组中 NF-YC9-FLAG 的捕获是特异性的，排除了抗体的非特异性结

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