荧光定量PCR（qPCR）是一种在标准PCR技术基础上演变而成的技术，主要用于定量样本中的DNA或RNA。它通过监测每个PCR循环中扩增产物的量，实现对靶点起始量的精确测定。本文将深入探讨荧光定量PCR中的关键曲线，包括扩增曲线、熔解曲线和标准曲线。

 qPCR扩增程序

荧光定量PCR的扩增程序分为扩增反应阶段和熔解反应阶段。

1.扩增反应阶段

扩增反应阶段采用两步法，即每个循环结束后，即刻检测荧光信号。这种实时监测方式使得qPCR能够动态地捕捉扩增过程中的荧光信号变化，进而生成扩增曲线。扩增曲线反映了靶标DNA片段的指数扩增阶段，曲线上的荧光强度随PCR循环数的增加而呈指数增长。该曲线的斜率（或Ct值）与起始模板的量呈负相关，可以准确地定量目标基因的表达水平。

2.熔解反应阶段

在扩增反应结束后，设置熔解反应程序，使双链DNA产物逐步解链，并检测荧光信号的变化。不同序列的DNA片段在不同的温度下解链，熔解曲线呈现出峰值，峰值温度可以用于判断扩增产物的特异性。如果存在非特异性扩增产物，熔解曲线会表现出多峰现象，从而提示可能存在杂交带或其他非目标序列的扩增。

 扩增曲线 

在PCR反应过程中，荧光信号的强度随着循环次数的增加而增加。扩增曲线显示了荧光信号随时间的变化，通常在Ct值（阈值循环数）处会有明显的信号上升，表示目标DNA的扩增开始。理想情况下，PCR产物呈指数增长，导致曲线呈典型的“S”形。然而，实际反应过程中，多种因素会影响扩增效率，例如酶活性降低、底物耗尽以及产物抑制等，最终导致曲线从指数期过渡到平台期。

扩增曲线的三个阶段

1.荧光背景信号阶段（基线期）：

在这个阶段，荧光信号的强度非常低，几乎没有显著变化。此时，PCR反应中的荧光信号主要来自于背景噪声。

荧光信号指数扩增阶段（对数期）：

随着PCR反应的进行，目标DNA的数量开始迅速增加，荧光信号也随之上升。此阶段的荧光信号呈指数级增长，通常是数据分析的关键部分，因为在此阶段可以准确测定Ct值（阈值循环数）。

平台期（扩增产物不再呈指数级增加）：

当PCR反应接近完成时，扩增产物的数量达到饱和，荧光信号的增加速度减缓，最终趋于平稳。这一阶段的信号变化较小，通常不用于定量分析。

通过分析扩增曲线，可以评估PCR反应的效率和特异性，并推断样本中目标DNA的初始量，为后续的定量分析提供依据。

扩增曲线示意图

在扩增曲线中这几个专业术语了解一下：

基线：是指在PCR扩增初期，荧光信号未显著增加的阶段，通常用于确定Ct值的起始点。基线设置在扩增曲线的平缓部分，通常为PCR的最初3至15个循环；可自动生成或手动设置，设置时需确保消除荧光背景的同时，不覆盖非荧光背景的扩增信号。

阈值：是在扩增曲线的指数增长区域内，选择的荧光检出界限。阈值应位于曲线的指数期中间，通常设置为基线荧光值标准差的10倍。对于不同基因的扩增，可以单独设置阈值，但同一个基因的扩增必须保持相同的阈值。

Ct值（Cycle threshold）：是指在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经历的扩增循环次数。Ct值与模板的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。Ct值通常取15至35之间的值，过大或过小都会影响定量分析结果的准确性。

2.优良的扩增曲线的特点

清晰的基线期：在荧光背景信号阶段，曲线保持平稳，未出现明显的荧光信号升高。指数扩增阶段：在对数期，曲线呈现出陡峭的上升趋势，显示出荧光信号的快速增加，表明PCR产物在有效扩增。平台期：在扩增产物达到饱和后，曲线应趋于平稳，表示扩增不再呈指数级增加。

扩增效率：理想的扩增效率应在90%-110%之间，确保每个循环中DNA的有效倍增。

无非特异性扩增：扩增曲线应无多余的条带或信号，确保特异性扩增目标序列。

一致的重复性：在重复实验中，扩增曲线应表现出一致性，确保结果的可靠性。

 熔解曲线 

熔解曲线分析是在PCR扩增结束后进行的，通过逐渐升高温度来分析PCR产物的特性。熔解曲线显示了DNA双链在特定温度下解链的过程，能够帮助确认扩增产物的特异性和纯度。

1.原始图谱与导数图谱

熔解曲线原始图谱通常展示了PCR扩增产物在不同温度下的荧光强度变化。

原始图谱示意图

熔解曲线导数图谱主要用于更清晰地展示PCR产物在不同温度下的解离特性。

导数图谱示意图

2.熔解曲线解析

通常情况下，荧光定量PCR扩增的产物长度在80到200个碱基对之间，对应的熔解温度大约在80到90℃。如果阴性对照没有扩增，可以通过熔解曲线来验证扩增产物的特异性：

单峰：如果在80到90℃之间出现一个清晰的单峰，说明PCR产物特异性很好，扩增成功。

双峰：如果出现两个峰，主峰在80到90℃之间，杂峰在80℃以下（通常60到75℃），可能是存在引物二聚体。可以尝试提高退火温度、降低引物浓度或重新设计引物来改善。

非特异性扩增：如果主峰在80到90℃，而在90℃以上又有杂峰，通常表示非特异性扩增。若是基因组DNA污染导致的，可以通过设计跨内含子的引物或去除基因组DNA来解决。

 标准曲线 

构建标准曲线，将标准品稀释成至少5个不同浓度。横轴代表起始拷贝数，纵轴为Ct值，绘制标准曲线，以建立Ct值与拷贝数之间的定量关系。

标准曲线示意图

标准曲线的一些参数能够反映荧光定量PCR体系的性能，其中斜率反映了PCR的扩增效率。理论上斜率为-3.32，表示100%的扩增效率，这意味着每个循环PCR产物量理论上翻倍。

实际实验中，PCR反应并非每个循环都实现完美倍增，通常有以下两种情况：

1. 若扩增效率低于100%，可能是由于引物、试剂或反应条件不合适，或标准品稀释不准确。

2. 若扩增效率高于100%，则可能存在抑制因素，如模板质量差或浓度过高，非特异性扩增也可能导致效率过高，需要通过熔解曲线进一步验证。

因此，扩增效率在90%至110%的范围内，仍可用于数据分析。但效率偏离此范围，则需谨慎对待结果，并追溯潜在因素。

好的，荧光定量的三种曲线讲解就到这里了，希望大家有所收获~点赞关注康旭禾生物，不定期给大家分享更多实用的干货！

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