在单细胞测序领域，研究者常权衡于采用单细胞核转录组测序（snRNA-seq）或单细胞转录组测序（scRNA-seq）。目前，从已发表的文章来看，scRNA-seq是主流方法，但该方法仍存在一定局限性。对于scRNA-seq，无论制备单细胞悬液还是制备原生质体悬液都需采用热酶解法，然而越来越多的研究表明，在这种条件下细胞可能受到刺激，导致胁迫相关应答基因表达增加，从而“人为改变”细胞的转录模式，引起转录偏好，最终导致所获得的数据无法真实反映细胞的转录状态，降低了数据的可靠性[1-6]。snRNA-seq不受解离条件的限制，适用样本类型丰富，可通过冻存组织送样进行抽核实验，避免酶解法引入的应激反应和解离偏好性，解决了上述问题。   

下面就跟小编一起来看一下具体案例吧~

案例展示

Case presentation

案例一

2020 年，Michal Slyper等人在Nature上发表了题为“A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors”的文章。通过对多组样本snRNA-seq与scRNA-seq的对比发现，snRNA-seq测序检出免疫细胞较少：神经母细胞瘤中，相比 snRNA-seq，scRNA-Seq 中免疫细胞比例更高，神经嵴、神经内分泌细胞等实质细胞大幅减少；而 snRNA-Seq 结果中实质性细胞（尤其是恶性细胞）比例更高，但 T 细胞比例大幅减少，B 细胞和 NK 细胞基本消失，内皮细胞、上皮细胞占比增加，这一发现在其余的 7 种组织类型中也得到了验证。文章认为，scRNA-Seq 由于解离处理可能使实质细胞受到损伤，导致实质细胞减少，也可能诱导免疫激活和即时早期反应，导致免疫细胞增多。

案例二

2023年5月发表在Genome Medicine上题为“Single-nucleus RNA sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes β-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles”的文章。snRNA-seq与冷冻样品兼容，消除了解离诱导的转录应激反应，并提供了可用于识别前体 mRNA 转录本的内含子序列的增强信息。

案例三

2023年5月发表在Nature上题为“A pan-grass transcriptome reveals patterns of cellular divergence in crops”的文章。在禾本科植物中，不同物种是平行驯化的，从而产生了各种具有独特进化历史和特征的作物。这些物种关键性状的区分是通过专门的细胞类型介导的。该研究对拟南芥和玉米的scRNA-seq和snRNA-seq数据进行比较，原生质体制备的方法由于不同植物和组织的差异性，适应性较为有限，且可能引入应激反应，对后续研究造成干扰。单细胞核转录组则能够识别特异的细胞类群并提供更完整的基因表达模式。

案例四

2021年3月发表在Molecular Plant上题为“Single-nucleus RNA and ATAC sequencing reveals the impact of chromatin accessibility on gene expression in Arabidopsis roots at the single-cell level”的文章。文中报道了拟南芥根组织中snRNA-seq和单个核的ATAC测序（snATAC-seq）。通过与已发表的原生质体转录组比较，验证了snRNA-seq进行植物单细胞图谱构建的可靠性。此外，snRNA-seq的结果揭示了之前scRNA-seq并未鉴定到的新的细胞类型。

此外，在查阅相关文献的过程中发现，研究者均一致认为制备原生质体会引起基因表达的变化。

2023 年 发表在Nature Communications 上题为 "Single-cell analysis identifies genes facilitating rhizobium infection in Lotus japonicus" 的文章。专家评审意见中指出制备原生质体会引起胁迫相关基因表达并对后续的数据分析产生影响[11]。

2022年发表在Nature Commucication的题为“A 3D gene expression atlas of the floral meristem based on spatial reconstruction of single nucleus RNA sequencing data”的文章。作者回复专家评审意见中指出选择分离细胞核而不是原生质体并非是由于制备花部组织高质量原生质体困难，而是原生质体处理可能会导致基因表达的变化。进行snRNA-seq可以避免原生质体处理可能产生的转录组变化[12]。

2023 年发表在Cell Reports 上题为 "Single-cell profiling of Arabidopsis leaves to Pseudomonas syringae infection" 的文章。作者提到制备原生质体的过程会影响转录组变化，尽管大规模RNA-seq数据分析可排除受原生质体影响显著表达的基因，但无法排除受原生质体影响诱导产生的防御反应[13]。

单细胞核转录组优势

样本适应性更强

单细胞核悬液制备对样本的状态要求较低，适用于固定、部分降解或难以处理的样本，如组织块和冰冻样本。细胞核的稳定性和抗损伤能力使得这种方法在处理这些挑战性样本时具有优势。

更适合某些特定性细胞类型

对于难以分离的细胞类型，如神经细胞或肌肉细胞，单细胞核悬液的制备方法可以更有效地处理这些细胞，避免了破坏坚固细胞膜或复杂细胞结构的风险。

 适用于大规模分析

由于其制备过程的稳定性和可重复性，单细胞核悬液适合于进行规模的单细胞分析，如整个器官或多种组织的综合分析，有助于大数据的生成和处理。

更低的物理损伤

制备单细胞核悬液的过程能更好地保持细胞完整性和RNA的完整性。这避免了因酶处理和物理操作导致的人为转录变化、降解或细胞死亡。

参考文献

[1] van den Brink SC, Sage F, Vértesy Á, Spanjaard B, Peterson-Maduro J, Baron CS, Robin C, van Oudenaarden A. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017 Sep 29;14(10):935-936.

[2] O'Flanagan CH, Campbell KR, Zhang AW, Kabeer F, Lim JLP, Biele J, Eirew P, Lai D, McPherson A, Kong E, Bates C, Borkowski K, Wiens M, Hewitson B, Hopkins J, Pham J, Ceglia N, Moore R, Mungall AJ, McAlpine JN; CRUK IMAXT Grand Challenge Team; Shah SP, Aparicio S. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 2019 Oct 17;20(1):210. doi: 10.1186/s13059-019-1830-0. PMID: 31623682; PMCID: PMC6796327.

[3] Farmer A, Thibivilliers S, Ryu KH, Schiefelbein J, Libault M. Single-nucleus RNA and ATAC sequencing reveals the impact of chromatin accessibility on gene expression in Arabidopsis roots at the single-cell level. Mol Plant. 2021;14(3):372-383.

Marand AP, Chen Z, Gallavotti A, Schmitz RJ. A cis-regulatory atlas in maize at single-cell resolution. Cell. 2021 May 27;184(11):3041-3055.e21.

[4] Sunaga-Franze DY, Muino JM, Braeuning C, Xu X, Zong M, Smaczniak C, Yan W, Fischer C, Vidal R, Kliem M, Kaufmann K, Sauer S. Single-nucleus RNA sequencing of plant tissues using a nanowell-based system. Plant J. 2021 Nov;108(3):859-869.

[5] Thibivilliers S, Anderson D, Libault M. Isolation of Plant Root Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. Curr Protoc Plant Biol. 2020 Dec;5(4):e20120.

[6] Shulse CN, Cole BJ, Ciobanu D, Lin J, Yoshinaga Y, Gouran M, Turco GM, Zhu Y, O'Malley RC, Brady SM, Dickel DE. High-Throughput Single-Cell Transcriptome Profiling of Plant Cell Types. Cell Rep. 2019 May 14;27(7):2241-2247.e4.

[7] Slyper M, Porter CBM, Ashenberg O, et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors [published correction appears in Nat Med. 2020 Jun 25;:].Nat Med. 2020;26(5):792-802.

[8] Kang RB, Li Y, Rosselot C, et al. Single-nucleus RNA sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes β-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles. Genome Med. 2023;15(1):30. Published 2023 May 1.

[9] Guillotin B, Rahni R, Passalacqua M, et al. A pan-grass transcriptome reveals patterns of cellular divergence in crops.Nature. 2023;617(7962):785-791.

[10] Farmer A, Thibivilliers S, Ryu KH, Schiefelbein J, Libault M. Single-nucleus RNA and ATAC sequencing reveals the impact of chromatin accessibility on gene expression in Arabidopsis roots at the single-cell level. Mol Plant. 2021 Mar 1;14(3):372-383.

[11] Neumann M, Xu X, Smaczniak C, Schumacher J, Yan W, Blüthgen N, Greb T, Jönsson H, Traas J, Kaufmann K, Muino JM. A 3D gene expression atlas of the floral meristem based on spatial reconstruction of single nucleus RNA sequencing data. Nat Commun. 2022 May 20;13(1):2838.

[12] Frank M, Fechete LI, Tedeschi F, et al. Single-cell analysis identifies genes facilitating rhizobium infection in Lotus japonicus. Nat Commun. 2023;14(1):7171. Published 2023 Nov 7.

[13] Zhu J, Lolle S, Tang A, Guel B, Kvitko B, Cole B, Coaker G. Single-cell profiling of Arabidopsis leaves to Pseudomonas syringae infection. Cell Rep. 2023 Jul 25;42(7):112676.

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