原理

 蛋白质印迹法 (WB) 是一种广泛使用的基于抗体的技术，借助抗体与目的蛋白（抗原）的特异性结合，检测细胞或组织提取物中的蛋白质表达水平。

 实验流程图

小编将详细介绍蛋白免疫印迹实验的步骤，并提供结果分析的指导，助大家更好的完成实验。

实验步骤

01

样品制备

蛋白免疫印迹实验的第一步是样品制备。通常，您可以从细胞培养物、动物组织或微生物培养物等样品中收集蛋白质。在此过程中，您需要避免蛋白质的降解和失活。

以下是一般的样品制备步骤：

a. 收集细胞或组织：使用适当的缓冲液洗涤细胞或组织，以去除杂质和外部污染物。

b. 细胞破碎：加入蛋白提取缓冲液（含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），破坏细胞膜和核膜，释放蛋白质。

c. 离心：将细胞裂解液或组织裂解液进行离心，去除细胞碎片和核酸等杂质。

d. 收集上清液：将上清液转移到新的离心管中，以去除未溶解的固体。

02

蛋白质浓度测定

在进行免疫印迹实验前，您需要确定蛋白质的浓度，以便加载相同的蛋白质量进行电泳分离。有几种方法可用于测定蛋白质浓度，如BCA法或Bradford法。

a. BCA法（双硫键还原法）：首先，准备一系列蛋白质标准溶液，使用BCA试剂与蛋白质反应，生成可测定光密度的复合物。

b. Bradford法：该方法使用考马斯亮蓝G-250试剂，该试剂与蛋白质结合形成深蓝色物质，测量其吸光度。

03

SDS-PAGE电泳

SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种将蛋白质按照分子量大小进行分离的常见方法。以下是简要的步骤：

a. 准备凝胶：根据实验需要选择合适的聚丙烯酰胺凝胶浓度和孔隙度。通常使用10%至15%的凝胶。

b. 配制电泳缓冲液：根据实验室的标准操作程序制备Tris-缓冲溶液，加入适量的SDS和硫酸铵，调整pH值。将电泳缓冲液加入电泳槽中。

c. 加载样品：将样品蛋白质与加载缓冲液混合，加热至95°C，使之变性。然后，将样品加载到凝胶孔中。

d. 电泳：将凝胶浸入电泳槽中，将电泳槽两端连接到电源，施加适当的电压使蛋白质沿凝胶电泳。

e. 停止电泳：当蛋白质移动到合适位置或接近凝胶底部时，停止电泳。

f. 凝胶染色：使用染色剂（如Coomassie蓝染液）对凝胶进行染色，以显示蛋白质带状。

g. 存储凝胶：将凝胶转移到显影仪或图像记录系统中，记录凝胶图像以备后续分析使用。

04

转膜

转膜是将凝胶上的蛋白质迁移到膜上的一个步骤，以便进行抗体的探针检测。常用的膜材料有聚偏氟乙烯（PVDF）和硝酸纤维素（NC）。以下是转膜步骤：

a. 准备膜：切割适当大小的膜，并将其在转膜缓冲液中湿润。

b. 电泳后处理：取出凝胶，将其在转膜缓冲液中浸泡一段时间

c. 转膜装置组装：将湿润的膜放在转膜装置上，层叠在凝胶上。确保膜与凝胶之间没有气泡。

d. 转膜操作：将转膜装置组装到转膜槽中，添加足够的转膜缓冲液，使其覆盖整个膜和凝胶。连接上正负电极，施加适当的电压，进行转膜操作。

e. 转膜结束：当蛋白质完全转移到膜上后，停止转膜操作。取出膜并进行后续的处理。

05

封闭

在进行抗体结合之前，需要对膜进行封闭，以避免非特异性结合和减少背景信号。一般会使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉作为封闭剂。以下是阻断步骤：

a. 准备封闭缓冲液：在TBST缓冲液中加入适量的封闭剂（通常为5%脱脂奶粉或1% BSA）。

b. 封闭操作：将膜放入封闭缓冲液中，轻轻摇晃，使其完全接触。

c. 封闭时间：通常封闭操作需要1-2小时，室温进行。

06

抗体孵育

抗体孵育是关键步骤之一，用于特异性结合目标蛋白。以下是抗体孵育步骤：

a. 准备一抗：选择与目标蛋白特异性结合的一抗。

b. 稀释抗体：根据供应商提供的建议或先前的优化实验，将抗体稀释到适当浓度的封闭缓冲液中。

c. 抗体孵育：将膜放入含有稀释抗体的封闭缓冲液中，使其与目标蛋白进行特异性结合。孵育温度和时间根据抗体的要求进行设定。

d. 洗涤：在抗体孵育后，将膜放入封闭缓冲液中进行洗涤，去除非特异性结合的抗体。

07

二抗结合及探针检测

在经过一抗结合后，通常需要使用与一抗相对应的二抗进行结合，该二抗与一个酶、荧光染料或放射性标记结合，以提供可检测的信号。

a. 选择二抗：根据一抗的物种来源，选择相应的二抗。

b. 稀释二抗：根据供应商提供的建议或先前的优化实验，将二抗稀释到适当浓度的TBST缓冲液中。

c. 二抗结合：将膜放入含有稀释二抗的TBST缓冲液中，使其与一抗进行结合。

d. 探针检测：根据二抗的标记物，选择合适的方法进行探针检测。例如，可以使用酶底物进行着色、荧光探针进行荧光检测，或者用放射性探针进行放射性测量。

08

图像获取及分析

使用分析系统（如显影仪、荧光成像仪或放射性显像系）获取膜上的图像，并进行后续的分析。以下是常见的图像分析步骤：

a. 图像获取：将膜放入相应的图像获取系统中，进行图像记录。

b. 图像分析：使用图像处理软件对图像进行分析，测量蛋白质带的密度和大小。

c. 定量分析：通过与适当的内部参考蛋白或总蛋白的相对定量比较，确定目标蛋白的相对表达水平。

结果分析

1.信号强度：根据图像分析的结果，观察目标蛋白带在膜上的信号强度。较强的信号表示高蛋白质表达，较弱的信号可能表示低蛋白质表达。

2.分子量大小：通过与分子量标记品对比，在凝胶上的目标蛋白带迁移位置来估计其分子量大小。

3.特异性：确保只有目标蛋白带出现信号，而其他非特异性结合的蛋白不产生信号。检查其他带状信号是否与预期的目标蛋白大小和形态相符。

4.负对照和阳性对照：分析实验中的负对照和阳性对照结果，以验证实验方法的有效性和可靠性。

5.统计学分析：使用适当的统计学方法（如t检验或方差分析）对结果进行统计学分析，确定差异的显著性。

     需要注意的是，蛋白免疫印迹实验是一种复杂的技术，结果分析需要综合考虑实验中的多个因素，并结合之前的研究背景和目的进行解读，对于结果的进一步分析和解释，可能需要借助其他实验或技术的支持。

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