实验名称虽相撞，看我如何巧分辨。

IP、CoIP、CHIP、RIP傻傻分不清？别着急，看完这篇你就懂了，包教包会！

我们先掌握共性部分，再记住区分要点，这样就可以啦！

免疫沉淀（IP）

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是一种研究蛋白质间交互作用的生物技术，这种技术是将蛋白质视为抗原，并利用抗体与之进行特异性结合的特性，来进行研究。这项技术可用来将含有上千种不同蛋白质的样品中，分离和浓缩出特定蛋白质。进行免疫沉淀法时，抗体需要和一个受质结合。

IP的实验原理很简单，就和“捕鱼”一样，通过抗体特异性结合目标蛋白，然后把它从复杂的样本环境中分离出来。

早期的IP实验，抗体是预先结合在树脂表面的，这些树脂铺在反应管的底部，然后再加入含有目标蛋白的溶液进去。

等待目标蛋白和抗体结合在一起，再通过离心去除杂质、洗涤液洗干净残留杂质，最后用洗脱液把蛋白从树脂上洗下来。

现在，IP实验除了采用树脂，也可以采用抗体加入样本环境中和蛋白结合，然后再加入一种叫Protein A/G的磁性微珠，它能“抓住”抗体的FC段，形成一个“磁珠-抗体-蛋白”的复合体，接着就靠磁力去富集这个复合体，再除杂和洗脱蛋白。

问题来了，把蛋白拿到手能干嘛？

在Western blot和质谱技术出来之前，IP实验拿到的蛋白缺乏定量分析的手段。因此，大家努力的方向更多的是集中在如何提高“捕鱼”效率——例如更好的去除杂质。

在Western blot和质谱技术诞生后，IP实验就变成了2部分：分离蛋白和分析蛋白。

借助Western blot，可以确认目标蛋白有没有、半定量分析有多少；借助质谱，可以获得蛋白肽段指纹图谱，通过和数据库比对匹配，就能解析蛋白的种类和组成，并且定量分析蛋白的摩尔浓度。

所以，IP实验常常用于什么研究呢？

既然它是“社交悍匪”，那细胞的各种生理活动肯定少不了蛋白质参与。正常的、异常的、疾病的各种变化，都需要先知道这个生理活动的机理——至少看看它是怎么社交嘛。

例如，看看这个生理现象的产生由什么蛋白决定或参与（蛋白鉴定），这些蛋白有没有相互关系（蛋白互作），它们参与的时候是什么状态（磷酸化？特殊修饰？）、通过什么方式参与的（蛋白互作还是与转录因子结合，还是与RNA结合？）。

基于以上研究的需要，在IP实验原理的基础上，就延展出了多个不同的应用方向：Co-IP、ChIP和RIP。

免疫共沉淀（CoIP）

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP），是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在agarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。

这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

蛋白产生相互作用，共同完成任务，如果蛋白A和B是依靠结合在一起产生作用的，那么通过IP实验把蛋白A分离出来，理论上也就把蛋白B也“抓”回来了。只要通过Western blot、蛋白质谱这些技术验证一下就能明确。

例如，乳腺癌中HER2蛋白过表达与侵袭性相关，在不明确致癌机制的前提下，如果推测HER2可能和PI3K激酶结合，并激活下游通路。

那么就可以拿HER2过表达的乳腺癌细胞系（如MCF-7）进行验证。加入抗HER2抗体，通过磁珠捕获HER2蛋白复合物。

洗脱复合物后，用Western Blot检测其中是否含有PI3K相关蛋白。有的话，就代表推测方向正确了。

不过，Co-IP和IP有一点重要的区别，就是蛋白互作形成复合体，是在细胞内处于天然生理环境下才具备的，因此，Co-IP只能从细胞或组织里获取蛋白，并且要用非变性的裂解条件来获取里面的蛋白，否则蛋白之间的相互作用可能就被提前破坏了。

那么，Co-IP实验后，如果发现了蛋白A和B，是不是就说明A和B是直接相互作用的呢？不能。

因为Co-IP只是证明了复合体里有蛋白A和B，但有没有其他蛋白？不确定。说不定A和B之间还有一个C作为桥梁呢，但Western blot就只能看到蛋白A和蛋白B的条带。所以Co-IP无法确定蛋白A和B是直接相互作用还是间接相互作用。

染色质免疫共沉淀（ChIP）

染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。

实验流程如下：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA片断——后续实验分析，如PCR分析，测序分析等。

那么，如果我们知道目标蛋白有什么，但不知道它们结合在哪里，就可以通过ChIP-seq高通量测序分析DNA片段，这样就可以确定过蛋白结合位点，类似的技术还有ChIP-qPCR和ChIP-chip。

比如，前列腺癌中，雄激素受体（AR）通过结合DNA调控下游基因（如PSA）表达，但具体结合位点不明确。

我们就可以对AR阳性的前列腺癌细胞系（如LNCaP）进行ChIP实验，使用抗AR的抗体捕获DNA-蛋白复合物。

ChIP-seq后分析，发现AR结合至多个基因启动子区，包括PSA基因的顺式作用元件。这样就明确了具体结合位点了。

进一步研究，对这些位点进行敲除后，发现细胞增殖减缓了、肿瘤体积缩小了，因此，就可以证实了AR的调控作用机理。

RNA免疫共沉淀（RIP）

RNA免疫共沉淀原理与ChIP相似，是一种用于定位体内的 RNA-蛋白质相互作用，它通过免疫沉淀目标蛋白来捕获蛋白体内结合的RNA。将捕获的RNA进行高通量测序，可获得RNA结合蛋白（RBP）在体内与众多RNA靶标的结合模式，并对其结合强度进行精确定量，最终通过分析目的蛋白在体内结合RNA的动态变化，阐述出目的蛋白对基因表达调控的分子机制。

RIP的实验流程与ChIP相似，与ChIP不一样的是，RIP反应体系中的试剂和抗体绝对不能含有RNA酶，抗体需经实验验证等等，同时不需要对细胞进行交联固定。

人类的绝大部分基因组不编码基因，而是产生非编码的RNA，这些非编码RNA参与几乎所有基因表达的转录后调控。而它们是以蛋白-RNA复合体（RBP）的形式完成这些事情的。

RIP技术就是RNA结合蛋白免疫沉淀，基于IP实验的基础而衍生出来的应用。RNA容易降解，所以要依靠紫外线（UVC）短暂照射细胞，使RNA与邻近蛋白的氨基/巯基交联，形成稳定的“RNA-蛋白锁链”。

这一方法既保留天然结合状态，又避免化学交联剂的毒性。完成这一步后，后续的操作就和IP差不多了。

RIP可以用于明确蛋白和RNA结合的对应关系，也可以用高通量测序找到RBP对应调控的靶基因。

以2008年《细胞》杂志发表的一篇论文为例，通过RIP-seq，成功揭示了miR-17-92簇在白血病中的“癌基因开关”作用——该miRNA家族通过结合300多个肿瘤抑制基因的3'UTR，抑制其翻译并促进细胞增殖。

主营项目

1. 动物实验

动物饲养、疾病造模、行为学检测、心功能、无创血压、血常规、全自动生化检测等

2. 细胞实验

CCK8/MTT、原代细胞分离、流式细胞实验、细胞划痕、侵袭、迁移、EDU染色、转染、稳定株

3. 分子生物学

PCR检测、荧光定量PCR、绝对定量PCR、端粒酶长度、pull down、双荧光素酶、SSR、SNP检测等

4. 蛋白实验

WB、Co-IP、酵母双杂

5. 病理实验

HE染色、免疫组学、电镜

6. 生理生化实验

肝肾功能、抗氧化、免疫反应等生理免疫指标;动植物营养指标、微量元素、重金属、酶活等。

7. 多组学实验

基因组、转录调控、蛋白组、代谢组、微生物多样性、宏基因组、生信分析

8. 整体课题实验

方案设计、整体实验交付、标书写作、论文润色、协助投稿

联系我们

康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

联系方式：15579126092      

公司官网：http://consurebio.com/

公司地址：江西省南昌市南昌县小蓝VR产业基地D座2楼