程序性细胞死亡(Programmed Cell Death, PCD)，是指细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后，为了维持内环境稳定而发生的一种主动性消亡过程。凋亡、自噬、细胞程序性坏死、细胞焦亡都是是程序性死亡的表现形式。
细胞焦亡是一种最新发现的炎症细胞程序性死亡方式，主要通过炎症小体介导包含Caspase-1在内的多种Caspase的激活，造成包括GSDMD在内的多种Gasdermin家族成员发生剪切和多聚化，造成细胞穿孔，进而引起细胞死亡。相比于细胞凋亡（apoptosis），细胞焦亡发生的更快，并会伴随着大量促炎症因子的释放。细胞焦亡在细胞形态学、生化特征以及基因水平上都与凋亡、自噬、铁死亡、坏死等传统的细胞死亡方式具有显著的差异，目前有数种检测细胞焦亡的方法，这篇文章将给各位概述目前常用的研究手段。

01

形态学变化

1. 倒置显微镜

从显微镜下观察细胞焦亡时，可看到典型的膜泡状结构（bubbles on the plasma membrane），这是由于细胞膜被穿孔，由于细胞内外渗透压差异，细胞发生肿胀引起。从分子机制上来说，细胞焦亡的发生依赖于gasdermin（GSDMs）家族蛋白在细胞膜上打孔。打孔完成后，成熟的IL-1β和IL-18，还有其它的细胞内容物DAMPs，如 ATP, HMGB1, S100 proteins, and IL-1a 释放出去，有别于细胞凋亡的炎症过程产生。

2. 扫描电镜如图1所示，可以清楚看到在细胞质膜破裂前，焦亡的细胞形成大量小泡，即焦亡小体。之后细胞膜上会形成孔隙，细胞膜破裂，内容物流出。

图1. Sham大鼠和急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡细胞电镜图(×7000). A: Sham组大鼠正常的腺泡细胞, 细胞核完整, 细胞膜无破裂. B: 急性胰腺炎组大鼠焦亡的腺泡细胞, 胞内容物外溢, 细胞膜破裂, 细胞核固缩.

02

检测焦亡相关蛋白

细胞焦亡的生化特征主要标志有炎症小体的形成，caspase和gasdermin的激活以及大量促炎症因子的释放。

1. q-PCR/Western Blot方法检测焦亡相关基因或蛋白的表达水平Western Blot：                                                                                                                                                     （1）Gasdermin D细胞焦亡发生时，Gasdermin D（GSDMD，53KD）被切割，产生30KD左右的片段，可以购买GSDMD一抗，用Western blot（WB）来验证。                               （2）Caspase-1、Caspase-4细胞焦亡发生时，caspase-1和caspase-4被激活，可以通过检测caspase-1和caspase-4的活性来验证。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                     图2. 检测 H37Rv 和 H37RvΔEST12 感染巨噬细胞 caspase-1 和 GSDMD 活性，H37Rv∆EST12 组与 H37Rv 组在感染后 1 小时内无明显变化。在刺激 6h 后，H37Rv 在 BMDMs 中诱导了更多裂解的 caspase-1 p20 和 GSDMD-N 末端片段（图 G）。在 BMDMs 中，与 BCG 相比 BCG-EST12 持续诱导更多的 caspase-1 p20 和 GSDMD-N 末端片段（图 J）。

2. ELISA检测IL-1β、IL-18等炎症因子的水平

炎性细胞因子IL-1β和IL-18在细胞焦亡中经历caspase-1依赖性激活和分泌。白介素-1β是一种有效的内源性热原，可刺激发热、白细胞组织迁移和多种细胞因子和趋化因子的表达。白细胞介素-18诱导干扰素γ的产生，对活化T细胞、巨噬细胞和其它细胞类型很重要。白细胞介素-1β和白细胞介素-18在一系列炎症和自身免疫性疾病的发病机制中起着至关重要的作用。

ELISA 检测 IL-1β分泌

03

TUNEL染色

DNA随机降解，不像细胞凋亡时，DNA降解为180-200bp及其整数倍的片段。染色体DNA断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

细胞TUNEL染色

04

细胞活性检测

1. CCK-8/MTT检测

2. 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NK细胞活性

乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内含酶之一。在正常情况下，不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中，释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶I (NADH2），后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm或570nm波长处有一高吸收峰，利用读取的OD值，经过计算即可得NK细胞活性。1．靶细胞制备　
取培养24～48h的靶细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×105／ml，备用。2．效应细胞的制备　
常规方法分离PBMC或小鼠脾细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1×107／ml。3．效-靶细胞作用
将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T＝100∶1)加入40孔细胞培养板的孔中，每份标本设3复孔，同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组(0.1ml靶细胞＋0.1ml 1％NP-40液)，低速离心1000r／min，2min后，置37℃、5％CO2温箱中孵育2h。4．酶促反应　
取出培养物，吸取各孔上清0.1ml加于另一培养板孔中，置37℃预温10min，每孔加入新鲜配制的LDH底物溶液0.1ml，室温避光反应10～15min，每孔加入1mol/L柠檬酸终止液30μl，以终止酶促反应。5．结果计算　
用酶联检测仪在570nm波长下读取各孔OD值，并计算NK细胞活性。

LDH 释放实验检测细胞毒性

05

总结

近几年细胞焦亡的持续火爆，细胞焦亡国自然中标项目数量逐年增加，尤其近两年呈直线上升趋势。PubMed中大于5分的相关研究文章超过2000篇；同时，从近几年命中的国自然项目中，我们也可以发现，在多种疾病或研究领域均有细胞焦亡的相关研究即将受到国自然基金委的资助。

主营项目

1. 动物实验

动物饲养、疾病造模、行为学检测、心功能、无创血压、血常规、全自动生化检测等

2. 细胞实验

CCK8/MTT、原代细胞分离、流式细胞实验、细胞划痕、侵袭、迁移、EDU染色、转染、稳定株

3. 分子生物学

PCR检测、荧光定量PCR、绝对定量PCR、端粒酶长度、pull down、双荧光素酶、SSR、SNP检测等

4. 蛋白实验

WB、Co-IP、酵母双杂

5. 病理实验

HE染色、免疫组学、电镜

6. 生理生化实验

肝肾功能、抗氧化、免疫反应等生理免疫指标;动植物营养指标、微量元素、重金属、酶活等。

7. 多组学实验

基因组、转录调控、蛋白组、代谢组、微生物多样性、宏基因组、生信分析

8. 整体课题实验

方案设计、整体实验交付、标书写作、论文润色、协助投稿

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康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

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