一、细胞蛋白提取实验步骤

1、细胞处理

①去除培养基
小心弃去六孔板中残留的细胞培养基，确保孔板内无多余液体，以避免干扰后续操作。

②PBS清洗
使用预冷的PBS溶液对细胞进行2 - 3次清洗，每次加入适量PBS后轻轻晃动孔板，使细胞充分浸润。随后，用滤纸轻轻吸干孔板底部的液体，注意避免过度吸干导致细胞损伤。PBS残留过多会导致后续裂解液浓度稀释，影响裂解效果。

③配制裂解液
在5毫升EP管中配制细胞裂解液。按100:1:1的体积比将RIPA强裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合均匀。在加入抑制剂时，将枪头伸至液面以下，轻轻吹打混匀，确保各成分充分溶解并均匀分布，以防止抑制剂在液面上形成气泡或分层。

④加入裂解液
向六孔板的每个孔中加入100 - 200微升配制好的RIPA裂解混合液。加入时，从高处逐滴加入，尽量使液体均匀铺满孔底，避免局部裂解液浓度过高或过低。随后将孔板置于冰上静置15分钟，以促进细胞充分裂解。

⑤刮取细胞
使用细胞刮刀轻轻刮取细胞，每个孔刮1分钟。先进行水平刮取，再进行斜向刮取，确保细胞完全从孔板表面脱落并汇集至孔底。刮取过程中动作要轻柔，避免过度刮取导致细胞碎片过多，影响后续蛋白提取的纯度。

⑥收集细胞
将刮下的细胞悬液转移至1.5毫升EP管中，置于冰上静置10分钟，使细胞进一步裂解，释放出更多的蛋白成分。

2、蛋白提取与纯化

①超声处理
对收集好的细胞悬液进行超声裂解处理。设置超声仪参数为每次超声5秒，间隔3秒，重复4次，功率为25%。超声过程中需将样品置于冰浴中，以防止蛋白因高温变性。超声处理可进一步破碎细胞，确保细胞内蛋白充分释放。

②离心分离
将超声处理后的细胞悬液在4℃条件下，以12000 - 14000转/分钟的速度离心15分钟。离心完成后，小心取出EP管，将上清液转移至新的EP管中，弃去沉淀。上清液中含有可溶性蛋白，是后续实验的主要研究对象。

3、蛋白定量与处理

①测定蛋白浓度
从上清液中取2微升样品，采用BCA法进行蛋白浓度测定。准确测量蛋白浓度是后续实验（如SDS-PAGE、Western Blot等）的关键步骤，确保实验结果的可靠性和可重复性。

②加入上样缓冲液
按照4:1的体积比（蛋白上清液:loading buffer，此处loading buffer为5×）将loading buffer加入蛋白上清液中。例如，100微升蛋白上清液加入25微升loading buffer，充分混匀。上样缓冲液含有还原剂和染料，可使蛋白在SDS-PAGE电泳中均匀分布并呈现条带。

4、蛋白保存与后续处理

①热处理
将加入上样缓冲液后的蛋白样品置于100℃水浴中煮沸10分钟。煮沸过程中，蛋白会发生变性，使其在后续电泳中能够充分展开并均匀分布。煮沸时需用重物压住试管盖，防止蒸汽弹开试管盖。煮沸完成后，将试管置于桌面上进行离心，将冷凝在试管盖内的液体离心至管底，再进行后续混匀操作，以确保样品均质，保证实验结果的可靠性。

②样品保存
蛋白样品易降解，反复冻融和热处理后降解风险更高。因此，样品提取后最好分装保存。每次使用时仅溶解一管，用完即弃。在上样前再进行热处理效果更佳。样品可置于-80℃冰箱中保存，以最大限度延长蛋白的稳定性。

5、注意事项

①低温操作：整个实验过程应在低温环境下进行，以减少蛋白降解的可能性。所有试剂和耗材均需提前置于冰上预冷。

②裂解液配制：配制裂解液时，需严格按照比例添加各成分，并确保充分混合均匀，以保证裂解效果。避免裂解液长时间暴露在空气中，防止抑制剂失效。

③细胞刮取：刮取细胞时动作要轻柔，避免过度刮取导致细胞碎片过多，影响后续实验结果。确保细胞完全脱落并汇集至孔底，避免残留细胞影响蛋白提取效率。

④超声处理：超声时间不宜过长，以免过度破坏蛋白结构，影响后续分析。超声过程中需密切观察样品状态，避免产生过多泡沫。

⑤样品保存：蛋白样品分装保存时，尽量减少分装次数，避免反复冻融对蛋白造成损伤。每次取用时仅解冻一管，用完即弃，避免反复冻融。

⑥离心操作：离心时需确保离心机温度设置为4℃，以保证蛋白在低温环境下稳定。离心完成后，小心操作，避免剧烈震荡导致蛋白沉淀重新悬浮。

⑦蛋白浓度测定：在进行BCA法测定蛋白浓度时，需严格按照试剂盒说明书操作，确保标准曲线的准确性。样品和标准品的体积需精确测量，以保证结果的可靠性。

6、常见问题及解决方法

①蛋白降解：如果发现蛋白样品出现降解现象，可能是由于裂解液中抑制剂不足或样品未在低温环境下保存。建议增加抑制剂的用量，并严格控制实验温度。

②蛋白浓度测定不准确：如果蛋白浓度测定结果偏差较大，可能是由于标准曲线制备不准确或样品处理不均匀。建议重新制备标准曲线，并在样品处理过程中增加混匀步骤。

③超声处理不充分：如果超声处理后发现细胞裂解不完全，可能是由于超声功率不足或超声时间过短。建议适当增加超声时间和功率，但需注意避免过度超声导致蛋白变性

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