ell Counting Kit-8（简称CCK8）是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。

WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，是一种类似于MTT的化合物，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物（formazan）。

细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

No.1

应用领域

CCK8（Cell Counting Kit-8）实验作为一种高效、便捷的细胞活性检测方法，在多个领域发挥着关键作用。

在药物研发领域，CCK8 实验是评估药物对细胞增殖、毒性影响的重要手段。科研人员通过向培养的细胞中加入不同浓度的药物，利用 CCK8 检测细胞活性变化，筛选具有潜在治疗效果的药物，同时评估药物的安全性和毒性。例如，在抗癌药物研发中，通过 CCK8 实验可以判断药物对肿瘤细胞的抑制效果，为后续临床试验提供数据支持。

在细胞生物学研究中，CCK8 实验常用于研究细胞的生长特性、增殖能力以及细胞周期调控机制。通过对不同处理条件下细胞活性的检测，探究细胞在各种因素影响下的生长变化。比如，研究细胞因子对细胞增殖的促进作用，或是外界环境因素（如温度、酸碱度）对细胞活性的影响。

此外，在毒理学研究中，CCK8 实验可用于检测化学物质、重金属等对细胞的毒性作用，评估环境污染物对生物体细胞的潜在危害，为环境保护和职业健康提供科学依据。在干细胞研究领域，CCK8 实验能够监测干细胞的增殖能力和分化过程中的活性变化，有助于优化干细胞培养和分化条件。

No.2

实验原理

CCK8 实验的原理基于细胞内线粒体中的脱氢酶。活细胞内线粒体中的脱氢酶能够将 CCK8 试剂中的 WST-8（化学名：2-(2 - 甲氧基 - 4 - 硝基苯基)-3-(4 - 硝基苯基)-5-(2,4 - 二磺酸苯)-2H - 四唑单钠盐）还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。

产生的甲臜量与活细胞数量呈正相关，细胞活性越高，线粒体脱氢酶活性越强，生成的甲臜就越多。

通过酶标仪在 450nm 波长处测定吸光度值（OD 值），根据标准曲线或直接比较 OD 值，即可准确反映细胞的活性和数量 。

No.3

实验步骤

一、铺板

1. 对前一天培养好的细胞消化、离心、计数。

2. 在96孔板上接种100μL 3000-7000/孔的细胞，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下继续培养12-24 h。

注意：

具体的细胞数量会根据细胞的大小和增殖速度而定。每个实验组需设置3-5个复合孔。

因最外圈会出现边缘效应（边缘孔的湿度较中间孔低，水分挥发的现象更为严重），96孔板最外圈不做任何处理加入200μL PBS或细胞培养液。

细胞铺板时，一定要边混匀细胞边铺板，最好用排枪铺板，减少铺板所用时间，铺板后立即观察铺板密度是否均匀，如果不均匀则标记出密度不均匀孔，弃去该孔。

二、给药

按照梯度进行细胞给药处理，通常每组至少设置3个复孔，给药梯度一般为倍数稀释，可设置2或5梯度，给药结束后细胞放入细胞培养箱内继续孵育。

注意：

给药方法因人而异，可以吸去原有培养基再给药，也可以不弃去原有培养基，直接100μL+100μL给药，但此时需要注意浓度配成终浓度的2倍。

三、结果检测

贴壁细胞：吸弃原细胞培养液，按照 CCK8试剂：细胞培养液=1：10，对每个孔加入90-110μL 含CCK8溶液的细胞培养液；

悬浮细胞：直接在原培养液内加入10μL CCK8溶液。

注意：

CCK-8试剂需要避光处理，在加入试剂时需注意对环境进行避光处理，加CCK-8试剂时的速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入CCK-8试剂后轻轻震荡96孔板，避免加样时由于CCK-8 残留在枪头或壁上上所带来的误差。

加入完毕后细胞继续放入细胞培养箱内孵育0.5-3h。

孵育完成后，使用酶标仪在450nm 处检测吸光度。

注意：

建议每半小时测定一次OD值，使其保持在1至2之间后固定显色时间重复实验。

用Excel及Graphpad Prism处理并分析结果。

结果示例图：

No.4

检测与数据处理

孵育结束后，使用酶标仪在 450nm 波长处测定各孔的吸光度值（OD 值）。记录数据后，利用 Excel、GraphPad Prism 等软件进行数据分析，绘制细胞生长曲线、计算细胞增殖抑制率或细胞毒性等指标。

No.5

CCK8常见问题

CCK8法细胞毒活性筛选实验中会遇到的常见问题

（1）一个孔中应接种多少个细胞？

当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

（2）哪些物质会影响CCK8的测定？

当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等。在有酚红存在的情况下，可通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，不会对检测造成影响。

（3）能否用384孔板或24孔板进行试验？

可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。

（4）CCK-8能否对活细胞进行染色？

不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST-8)，并通过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。

（5）在实验中吸光度值太高，如果不能减少细胞数量，如何解决？

可以缩短加入CCK-8后的培养时间。例如: 可以把加入CCK-8试剂后的培养时间由2小时缩短为1小时。

（6）设定参比波长的目的是什么？必须设定吗？

不一定要设定。CCK-8试剂在参比波长没有吸光度。设定参比波长的目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。

（7）CCK-8检测溶液对细胞是否有毒？

加到培养基中的CCK-8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK-8检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK-8的耐受力都不同，因此在需要进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK-8培养后的活力。

（8）CCK-8能否检测细菌细胞？

可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100μl E.coli培养液中加入10μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。

（9）CCK-8稳定吗？

CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。如果需要长期保存，我们推荐-20℃的储藏条件。CCK-8若反复解冻和冰冻将会增加空白吸收，从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内保存。

（10）每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？

可能会有以下几个原因：1. 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2. 有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。3. 每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔范围内摸索条件。

（11）如何设定空白对照？

在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

（12）在CCK-8显色过程中，如何终止反应？

有以下几种方法（96孔板）：①在显色反应后，将培养板放置4℃冰箱内。②每孔加10μl 0.1 MHCL溶液。③每孔加10μl的 1%（w/v）的SDS（十二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之内测定。

（13）必须预培养细胞吗？

不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养 ，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

（14）CCK-8对于不同的细胞，灵敏度是否一样？

不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加入CCK-8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光度较低，可以通过延长CCK-8的加入时间或增加细胞数量来解决。

（15）悬浮细胞和贴壁细胞在数量上有何区别？

悬浮细胞由于染色比较困那，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。贴壁细胞染色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪的读数。

（16）应该每次做标准曲线吗？

建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。

（17）有时在药物作用情况下，细胞已经死亡，但是脱氢酶的活性还在，是否能计算细胞数量？

不能。由于CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞数量将会比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法测定。

（18）实验前发现细胞不生长或生长缓慢是什么原因？
a. 细胞状态不好：可能是因为传代次数过多或者细胞本身存在异常，导致细胞增殖能力下降。此时，可以尝试更换细胞株或优化细胞培养条件。
b. 培养条件不合适：如培养基不合适、血清浓度不合适、温度和湿度不适合等。此时，可以尝试调整培养条件，选择更适合的培养基和血清。
c. 污染：细胞可能会被细菌、支原体等微生物感染，导致细胞生长停滞。此时，需要进行消毒和更换新鲜的培养基。

d. 细胞老化：细胞生长到一定阶段后，会逐渐进入老化状态，导致增殖能力下降。此时，可以尝试进行细胞换株或者优化培养条件。

（19）实验前发现细胞死亡是什么原因？
a. 血清浓度不合适：血清浓度过高或过低都会导致细胞死亡。此时，可以尝试调整血清浓度。
b. 温度和湿度不适合：如果温度过高或湿度过低，会导致细胞死亡。此时，可以尝试调整温度和湿度。
c. 细胞状态异常：如果细胞状态异常，如出现染色体异常、基因突变等情况，会导致细胞死亡。此时，需要进行细胞遗传学检测和表型分析等实验来确认细胞的性质。

（20）文献报道IC50值和实际测定值不一致是什么原因？

a.文献IC50测定方法和实际测定所用方法存在差异；

b.不同实验室细胞株来源、代次、培养方法存在差异，可能会影响细胞株对受试药物的敏感性；

c.实验操作过程中存在的误差；

d.受试药物的纯度、配制方法等可能存在差异。

故文献报道IC50值和实际测定值不一致的情况下需要客观分析。

主营项目

1. 动物实验

动物饲养、疾病造模、行为学检测、心功能、无创血压、血常规、全自动生化检测等

2. 细胞实验

CCK8/MTT、原代细胞分离、流式细胞实验、细胞划痕、侵袭、迁移、EDU染色、转染、稳定株

3. 分子生物学

PCR检测、荧光定量PCR、绝对定量PCR、端粒酶长度、pull down、双荧光素酶、SSR、SNP检测等

4. 蛋白实验

WB、Co-IP、酵母双杂

5. 病理实验

HE染色、免疫组学、电镜

6. 生理生化实验

肝肾功能、抗氧化、免疫反应等生理免疫指标;动植物营养指标、微量元素、重金属、酶活等。

7. 多组学实验

基因组、转录调控、蛋白组、代谢组、微生物多样性、宏基因组、生信分析

8. 整体课题实验

方案设计、整体实验交付、标书写作、论文润色、协助投稿

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康旭禾生物提供包括动物实验、细胞实验、分子实验、病理实验、流式检测实验及论文翻译、润色、投稿辅助等相关的各项服务。

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