在进行基因的功能研究时，主要策略有两个，一个是过表达，一个是做敲除或做干扰。在此过程中，细胞转染是很常规的操作，但是有时会遇到转染效率低，导致实验无法推进。今天我们分享下细胞转染过程的几个注意事项。

1. 关于启动子的选择。 启动子对于细胞转染效率有很大的影响。通常情况下，过表达质粒选择广谱强启动子CMV，干扰质粒选择U6或H1作为启动子（见下图）。在特殊情况下，对于特异性细胞的转染或感染，需要考虑用特异启动子，比如心肌细胞特异启动子cTNT，肝脏特异启动子TBG，神经特异启动子hsyn。启动子的选择对转染过程本身影响不大，但是对转染效率有很大的影响。

2. 质粒大小与质量。超螺旋结构质粒的转染效率比线性质粒高得多，特别是瞬时转染；但线性质粒转染的整合几率高。质粒越大，转染效率相应会降低。此外，质粒浓度及纯度也会影响转染效率。OD260/280在1.8~2.0，是一个基本的指标，即没有蛋白和RNA 污染。最重要的是内毒素要清除干净。内毒素清除的效果，才是是否用于转染的决定指标。纯化质粒的质量也会影响转染效率，尽量要选择高质量的质粒。

3. 转染试剂。在确定质粒和细胞之后，就要考虑转染试剂的选择了。转染试剂种类很多，如磷酸盐、脂质体和阳性聚合物等，脂质体转染试剂，如lip系列。针对一般细胞系，上述转染试剂的转染效率还行，但是针对一些难转染的细胞，如免疫细胞，悬浮细胞以及原代细胞，这些对转染试剂有比较高的要求，很多公司推出了新的转染试剂，如HighGene，PolyJet等等。如果以上方式不奏效，还可以考虑电转。

4. 对于难以转染的细胞，还可以通过慢病毒包装和感染的方式来实现。制备慢病毒穿梭质粒及辅助包装质粒，用无内毒素的试剂盒抽提，共转染 293T 细胞，转染后 18小时后更换为完全培养基，培养 48 小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，然后感染靶细胞。

一、转染试剂毒性问题

1. 原因

转染试剂本身可能对细胞有毒性。不同细胞系对转染试剂的耐受性不同，有些转染试剂可能会破坏细胞膜的完整性，影响细胞的正常生理功能。例如，阳离子脂质体类转染试剂，其带正电荷的脂质成分可能会与细胞膜上的负电荷成分过度相互作用，导致细胞膜损伤。

转染试剂的浓度过高是常见的导致细胞毒性的因素。如果按照不恰当的实验方案使用过量的转染试剂，会使细胞受到化学损伤，表现为细胞变圆、脱落、死亡等现象。

2. 解决方法

优化转染试剂的选择。在实验前，可以查阅相关文献，了解不同细胞系适用的转染试剂类型。对于一些比较敏感的细胞系，如原代细胞，可尝试使用低毒性的转染试剂，如病毒载体介导的转染系统或者非脂质体类的转染试剂。

优化转染试剂的浓度。进行浓度梯度实验，一般从较低浓度开始尝试，观察细胞在不同浓度转染试剂下的状态。确定一个既能保证转染效率又能使细胞毒性最小的最佳浓度。例如，在使用脂质体转染试剂时，可以设置一系列浓度，如 1 - 5μL/mL 培养基，通过检测转染后细胞的活性（如使用 MTT 法）和转染效率（如检测报告基因的表达）来确定最适浓度。

二、DNA质量及用量问题

1. 原因

DNA 纯度不够会影响细胞状态。如果 DNA 样品中含有内毒素、蛋白质或其他杂质，可能会引发细胞的免疫反应或毒性作用。例如，内毒素可以激活细胞内的炎症信号通路，导致细胞产生应激反应，出现生长迟缓、凋亡等情况。

过高的 DNA 用量也会对细胞产生不良影响。过多的外源性 DNA 进入细胞后，可能会干扰细胞内的正常基因表达调控机制，导致细胞代谢紊乱。同时，大量的 DNA 可能会形成难以溶解的复合物，对细胞造成物理损伤。

2. 解决方法

确保 DNA 的纯度。使用高质量的 DNA 提取试剂盒，并在提取后进行纯化处理，如通过柱层析或乙醇沉淀等方法去除内毒素和其他杂质。可以使用内毒素检测试剂盒检测 DNA 样品中的内毒素含量，一般要求内毒素水平低于 0.1 EU/μg DNA。

优化 DNA 用量。通过预实验来确定合适的 DNA 用量。对于大多数细胞系，转染的 DNA 量通常在 0.1 - 10μg 之间。在保证转染效果的前提下，尽量减少 DNA 的用量。例如，在转染某种哺乳动物细胞系时，从 0.1μg 开始逐步增加 DNA 用量，同时观察细胞状态和转染效率，找到最佳的 DNA 用量范围。

三、细胞本身的因素

1. 原因

细胞的生长状态对转染后的存活和功能至关重要。如果细胞在转染前生长不健康，如处于对数生长期晚期或已经过度汇合，细胞的生理功能可能已经受到影响，对转染过程的耐受性会降低。此时细胞的细胞膜流动性可能下降，内吞作用等与转染相关的细胞机制也会受到干扰。

不同的细胞系对转染的敏感性差异很大。有些细胞系，如 HEK293 细胞，相对容易转染且对转染过程的耐受性较好；而原代细胞等则比较敏感，容易在转染后出现状态不佳的情况。这是因为原代细胞的生理特性与永生化细胞系不同，它们保留了更多原始组织的特性，对环境变化更为敏感。

2. 解决方法

确保细胞在转染前处于良好的生长状态。一般选择处于对数生长期的细胞进行转染，此时细胞的活力和增殖能力最强。对于贴壁细胞，转染时的汇合度也很重要，通常保持在 70 - 80% 左右的汇合度较为合适。可以通过定期观察细胞形态、计数细胞数量和检测细胞活性（如台盼蓝染色法）来监控细胞状态。

根据细胞系的特点调整转染策略。对于敏感的细胞系，采用更温和的转染方法。例如，对于原代神经元细胞，可以使用电穿孔转染法，并优化电穿孔参数（如电压、脉冲时间等）以减少对细胞的损伤。同时，可以在转染后提供更适宜的培养条件，如添加神经营养因子等促进细胞恢复。

四、转染条件问题

1. 原因

转染的时间过长可能会对细胞产生负面影响。例如，在一些基于脂质体的转染过程中，如果脂质体 - DNA 复合物与细胞的孵育时间过长，细胞可能会过度摄取复合物，导致细胞内的代谢负担过重。

转染过程中的温度和二氧化碳浓度等环境因素也会影响细胞状态。不合适的温度会影响细胞的代谢速率和细胞膜的流动性，进而影响转染效率和细胞健康。例如，温度过高可能会加速细胞的代谢，使细胞内的酶活性异常，导致细胞应激；温度过低则可能会抑制细胞的内吞作用等转染相关机制。

2. 解决方法

优化转染时间。通过预实验来确定最佳的转染时间。一般来说，脂质体 - DNA 复合物与细胞的孵育时间在 2 - 6 小时之间。在孵育结束后，及时更换新鲜的培养基，以去除未被摄取的复合物和减少潜在的毒性物质。

严格控制转染环境条件。将细胞培养箱的温度和二氧化碳浓度设置在合适的范围内，通常温度为 37°C，二氧化碳浓度为 5%。可以使用温度和二氧化碳浓度监测设备来确保培养箱内环境的稳定性。

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