做基础研究的小伙伴有没有觉得实验思路好设计，但是如何筛选关键基因是个难题。今天看一篇，文章在筛选基因方面也做了大量分析，小伙伴们学会了，接着再做一篇基础研究，又是一篇sci到手。

1. 文献简介

Caveolin-1 identified as a key mediator of acute lung injuryusing bioinformatics and functional research

发表年份：2022

影响因子：9

期刊名称：Cell Death & Disease

2. 研究背景

急性肺损伤(Acute Lung Injury, ALI)是一种严重的呼吸系统疾病，通常继发于全身炎症反应。发病突然、发展迅速、预后差。然而，ALI的病理是复杂的，尚未完全阐明。通过生物信息学的分析可能有助于探索ALI的潜在机制，并有助于确定未来临床研究中使用的新靶点。本研究采用生物信息学方法分析了在线临床5个数据集，发现CAV-1和NF-κBp65的差异表达在ALI中很重要。此外，进一步在体内和体外验证了CAV-1和NF-κBp65的作用，同时也探索了CAV-1为ALI治疗提供新靶点的潜在机制。

3. 主要结果

 1. RCC原发和转移部位的scRNA景观图

为了研究RCC肿瘤的细胞异质性，对6例患者的原发肿瘤和其中2例患者的LN（淋巴结）转移进行了scRNA-seq谱分析(图1A, B；表1和表2)。随后进行质控，从6名患者中获得46,552个细胞进行scRNA-seq分析。基于染色体区域间的平均表达，计算每个细胞的全染色体推断拷贝数变异(CNVs)。以非恶性细胞为参照，CNVs呈现恶性细胞间的异常特征(图1C)，区分出30,514个恶性细胞和14,762个非恶性细胞。CNV基因表示为基于GO BP的基因集网络（图1D）。原发(malignant-pri)和转移(malignant-LN)恶性细胞的CNV评分均显著高于非恶性细胞(图1E)。恶性细胞的上皮细胞评分明显高于非恶性细胞 (图1F)。根据CNVs和上皮标记分析，大多数细胞是具有一致的恶性或非恶性分类的簇的一部分。

2.RCC的TME表征

14,762个非恶性细胞被聚类成7种主要的细胞类型(图2A)，包括T细胞、内皮细胞、巨噬细胞、B/浆细胞、NK细胞和成纤维细胞。T细胞和成纤维细胞亚群进一步以更高的分辨率聚集。如图2B所示，主要T细胞群分为CD8+ T细胞，CD4+ T细胞和调节性T细胞。540个成纤维细胞被重新聚集成两个亚组(图2C)。与非恶性细胞相比，基于单片UMAP算法的肿瘤异质性，共聚集了30,514个恶性细胞(图2D)。各恶性细胞簇表达前10位的标志物如图2E所示。

3. 恶性肿瘤细胞表达模式的异质性和转移程序的鉴定

接下来，研究了肿瘤亚群中异质性恶性细胞的表达模式是如何变化的。使用NNMF算法揭示恶性细胞集群倾向共表达的一致的基因集。确定了4个基因组在恶性细胞集群4的细胞中存在差异(图3A)。对6个恶性肿瘤集群中的每一个使用这种方法，确定了至少一个恶性肿瘤集群中单个细胞之间一致变化的总共60个特征基因。然后，应用分层聚类将60个特征基因提取为代表多个恶性亚群中不同共表达模式的元特征(图3B)。

在至少两个亚群的恶性细胞中有六种表达模式。如图3B所示，两个程序(簇1和2)主要由细胞角蛋白和EPCAM等上皮基因组成。另外一个程序反映了细胞周期的G1/S和G2/M期，并区分了每个恶性亚群中不同周期的细胞。最后一种程序富集了缺氧相关基因(图3B)。

 4. SERPINE2在转移过程中起关键作用

作者检查了所有RCC样本中参与转移- II程序的基因的表达。这些注释基因在所有RCC组织中表达，包括原发和转移样本，并且在至少两个样本中是top基因(图3C)在scRNA谱中检测了恶性和非恶性细胞之间的DEGs，发现了37个共同表达的基因，其中排名最高的基因位于NNMF程序中(图3D)。作者检查了TCGA生存数据中的所有常见基因以过滤出致癌基因(图3E)。过滤后，发现高表达的SERPINE2与较差的总生存期(OS)相关(图3E)。所有恶性scRNA亚群均表达SERPINE2，其中恶性1-3表达量更高(图3F)。此外，原发恶性细胞中SERPINE2表达最高(图3G)。GSEA和GSAV均表明，在SERPINE2含量高的恶性细胞中，细胞增殖、细胞运动和迁移途径显著富集。

接下来，作者比较了SERPINE2在RCC细胞系和正常肾上皮细胞系HK-2中的表达。结果发现，与其他RCC细胞系相比，Caki-1表达的SERPINE2最高。了解到Caki-1起源于人类RCC转移肿瘤部位，作者通过Hi-C、ATAC-seq，结合Caki-1与HK-2之间的RNA-seq，探讨了染色质空间结构和表观遗传因素是否参与了SERPINE2的基因和功能调控。SERPINE2位点的室状态为B(正常细胞系)至A (RCC细胞系)，该位点在ATAC-seq上呈开放状态，表明SERPINE2位点具有活跃的相互作用频率(图3H)。RNA-seq结果还显示，与HK-2相比，SERPINE2在Caki-1中高表达。此外，SERPINE2区域的TAD在HK-2和Caki-1之间存在差异，表明在Caki-1细胞中，随着新的TAD边界的产生，TAD的大小减小(图3I)。这些数据表明SERPINE2不仅在转录组水平上起作用，而且与RCC的基因组变化相关。因此，基于全基因组学和scRNA-seq, SERPINE2可能在RCC转移中发挥潜在作用。

5.SERPINE2在RCC和药物反应中作为转移相关癌基因

SERPINE2促进肿瘤转移的分子机制尚不清楚。作者根据SERPINE2的平均表达来评估TCGA患者的体细胞改变(高组，n = 164;低组，n = 168)。前人研究的RCC基因变化如图4A所示。SERPINE2高、低组MTOR、MUC16、NOTCH2和LPR1存在差异(图4A)。然后作者在TCGA两组间进行GSEA比较。EMT通路显著富集 (图4B)。与未发生转移的原发肿瘤组织(n = 199)相比，LN或其他转移患者的组织(n = 89)中SERPINE2的表达水平较高(图4C)。此外，转移患者中SERPINE2的表达也显著高于GSE105261队列正常组织(图4D)。在GSE53757队列中，SERPINE2在肿瘤中的表达明显高于正常组织(图4E)。接下来，基于最大的公开药物基因组学数据库cgp2016预测TCGA样本的药物反应。SERPINE2高组对舒尼替尼的IC50应答率较高，与SERPINE2低组相比应答率较低 (图4F)。Estimate算法可以计算出大样本的免疫浸润水平。作者发现SERPINE2高组的免疫浸润高于低组 (图4G)。因此，SERPINE2的表达也可能与免疫治疗有关。作者在scRNA-seq中检测MTOR的表达。SERPINE2高表达组MTOR表达增加 (图4H)。最终耗竭CD8+ T细胞的特征基因(PDCD1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、TOX、ENTPD1、BATF和PRDM1)整合在图4I中，提示终末耗竭的CD8+ T细胞实际上影响了免疫浸润。在接受nivolumab治疗的Checkmate025队列中，较高的SERPINE2表达与较差的生存率相关 (图4J)。这些数据提示SERPINE2可能是RCC中的一个恶性基因并参与药物反应。

6.SERPINE2促进体外和体内ccRCC侵袭，并伴有上皮-间质转化(EMT）

为了研究SERPINE2是否促进了RCC肿瘤的恶性生物学行为和转移，作者通过qRT-PCR验证了SERPINE2在RCC中的功能。结果显示，SERPINE2在Caki-1细胞中高表达，在786-O细胞中低表达。然后构建SERPINE2过表达细胞(786-O)和SERPINE2敲低细胞(Caki-1)，并通过qPCR和Western blot观察(图5G)。通过集落形成和CCK-8细胞增殖实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验检测SERPINE2表达对RCC细胞增殖和侵袭的影响。结果显示，sh-SERPINE2组RCC细胞迁移和侵袭明显减少(图5A, B)，OE-SERPINE2组显著升高(图5C, D)。sh-SERPINE2组细胞存活率显著降低(图5E)，OE-SERPINE2组细胞存活率显著升高(图5F)。此外，将786-O-OE-SERPINE2或786-O-NC-SERPINE2细胞注射到裸鼠尾静脉中，标记稳定荧光素酶。记录8周内的光子通量。结果发现，786-O-OE-SERPINE2组小鼠的肺转移较对照组小鼠更为严重 (图5G)。肺组织HE结果如图5H所示。碳酸酐酶9 (CA9)和SERPINE2在786-O-OE-SERPINE2诱导的肺转移部位高表达(图5H)。

7. 在的临床队列中，SERPINE2与低生存率相关，并预测RCC转移

作者验证了两个队列(TMA30, n = 29;TMA2020, n = 289)。H-score定量分析(图6A)显示，SERPINE2在肿瘤组织组中的表达高于肿瘤旁组织组(图6B)。根据临床信息对队列进行分类，发现SERPINE2在有转移的组织以及基于IHC评分的Fuhrman分级(图6D)或肿瘤分期 (图6E)较高的组织中表达明显较高(图6C)。根据使用TMA30的5年OS对SERPINE2进行ROC分析得出的最佳截断值，将患者分为高表达组和低表达组。H-score的临界值为202.5,AUC为0.8342(图6F)。Kaplan-Meier生存分析结果显示，SERPINE2-高亚组患者的OS较差(图6G)和无进展生存期(PFS) (图6H)。然后，对临床信息和SERPINE2进行nomogram分析(图6I)，发现SERPINE2表达是ccRCC患者OS的独立危险因素。

4. 结论

总之，本研究表明恶性细胞和TME的不同表达模式在RCC的进展中起着不同的作用。SERPINE2被认为是抑制晚期RCC转移的潜在治疗靶点。这篇文章通过单细胞+多组学研究筛选了关键的基因SERPINE2并进行了后续验证，虽然验证实验不是很多，但是文章依然可以发到9分，所以想发高分并不是只有实验一条路可以走，这篇文章的思路小伙伴可以学起来！

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