01论文基本信息 

标题：SH3RF3 promotes breast cancer stem-like properties via JNK activation and PTX3 upregulation

期刊：Nature Communications

影响因子：17.69

作者：Peiyuan Zhang, Yingjie Liu, Cheng Lian 等

发表日期：2020 年 5 月 19 日

DOI：10.1038/s41467-020-16051-9

关键词：乳腺癌干细胞；SH3RF3；JNK 通路；PTX3

02研究背景 

癌症严重威胁人类健康，肿瘤异质性使得癌症治疗面临挑战，癌症干细胞（CSCs）理论为解释肿瘤异质性提供了思路。乳腺癌干细胞（BCSCs）在乳腺癌的发生、发展、复发和转移中起关键作用，目前对其调控机制的了解尚不完整。SH3RF3 是一种含有多个结构域的蛋白质，其在癌症中的功能尚未明确，PTX3 在癌症中的作用存在争议 。

03实验设计 

筛选关键分子

通过流式细胞术分选 HMLER 细胞系，得到具有不同 BCSC 特性的亚群，进行转录组分析筛选与 BCSCs 相关的分子；分析公共转录组数据集，确定与临床肿瘤 BCSC 特性相关的基因，并与细胞系数据交叉分析，筛选出关键基因 SH3RF3。

功能验证

构建过表达和敲低 SH3RF3 的细胞模型，检测 BCSCs 相关指标（如 CD44+CD24 - 细胞比例、ALDH + 细胞比例、肿瘤球形成能力、体内成瘤能力等），验证 SH3RF3 对 BCSCs 特性的影响；构建过表达和敲低 PTX3 的细胞模型，检测其对 BCSCs 特性的影响，并通过 rescue 实验验证 PTX3 在 SH3RF3 调控 BCSCs 中的作用。

机制探究

运用 RNA 测序、ChIP-qPCR、荧光素酶报告实验、Co-IP 等实验，探究 SH3RF3 调控 PTX3 表达的信号通路及分子机制；分析 SH3RF3 与 JNK 信号通路相关蛋白的相互作用，确定 SH3RF3 激活 JNK-JUN 通路的机制。

临床相关性分析

培养患者来源的类器官，观察 SH3RF3 过表达对其形成的影响；分析 TCGA 乳腺癌队列、Qilu 队列数据及 Kaplan-Meier Plotter 数据库，探究 SH3RF3 表达与 BCSCs 特性、患者预后的相关性。

04实验结果

图 1：SH3RF3 表达与 BCSC 特性相关

a：HMLER 亚系衍生流程图及代表性图像。比例尺，100μm。

b：HMLER 亚系中肿瘤球的定量分析（n=3 次培养实验）及代表性图像。比例尺，100μm。

c：不同浓度紫杉醇（0 - 200ng/mL）和阿霉素（0 - 500nM）处理后，HMLER 亚系的 MTT 检测结果（n=4 次处理实验）。

d：HMLER 亚系中 CD44+CD24 - 和 ALDH+ CSCs 的流式细胞术分析。图中数字表示相应亚群的百分比。

e：临床肿瘤和 HMLER 亚系中与 CSC 特性相关的基因。热图展示了它们在 HMLER 亚系中的表达、与 TCGA 肿瘤中 CSC 特征的皮尔逊相关性（Corr_r）以及肿瘤球与原发肿瘤中表达的对数倍数变化（logFC）。

f：来自 HMLER、HMLE 和 MCF10AT 不同亚系中 SH3RF3 的表达（n=3 次细胞培养）。数据表示为平均值 ± 标准差。采用双尾无配对 t 检验确定统计学意义（b、c 和 f）。（b）和（f）中的实验独立重复三次，结果相似，展示其中一次代表性实验的数据

●细胞亚群分选及特性鉴定：通过流式细胞术将 HMLER 细胞系分为 CD44H（CD44+CD24-）和 CD44L（CD44-CD24+）亚群，对 CD44L 细胞连续进行肿瘤球培养获得 CD44LS 亚群。CD44H 和 CD44LS 亚群的肿瘤球形成能力增强，对化疗药物（紫杉醇、阿霉素）耐药性提高，且 CD44H 主要为 CD44+CD24-，CD44LS 细胞的 ALDH 表达更高，表明成功富集了具有不同 BCSC 特性的亚群。

●基因筛选与验证：对 CD44L、CD44H 和 CD44LS 进行 RNA 测序，分析差异表达基因。结合 TCGA 乳腺癌队列及患者来源肿瘤球与原发肿瘤的转录组数据集，筛选出 76 个与 CD44+CD24 - 特征和肿瘤球形成能力相关的基因，其中 21 个基因与 HMLER 亚系中鉴定的 CSC 相关基因重叠，SH3RF3 是其中之一。qRT-PCR 和 Western blot 分析证实 SH3RF3 在多种细胞系的 BCSC 亚群（如 HMLER 的 CD44H 和 CD44LS、HMLE 和 MCF10AT 的 CD44+CD24 - 亚群）中表达上调。

图 2：SH3RF3 促进乳腺癌细胞的 CSC 特性

a：HMLE、MCF10AT 和 MDA-MB-231 细胞中 SH3RF3 的过表达情况。

b：HMLE 和 MCF10AT 中 CD44+CD24 - 亚群以及 MDA-MB-231 中 ALDH + 亚群的流式细胞术分析。图中数字表示 CSC 百分比（n=3 次培养实验）。

c：过表达 SH3RF3 的乳腺癌细胞中肿瘤球形成的定量分析及代表性图像（n=3 次培养实验）。比例尺，100μm。

d：在第 28 天，注射连续稀释的 MDA-MB-231 细胞的小鼠体内肿瘤形成情况。

e：注射 40 个对照和过表达 SH3RF3 的 MDA-MB-231 细胞的小鼠的肿瘤图像和体积（n=10 只小鼠）。数据表示为平均值 ± 标准差。采用双尾无配对 t 检验（b 和 c）、卡方检验（d）或 Mann-Whitney U 检验（e）确定统计学意义。（a）、（b）（上）和（c）中的实验独立重复三次，结果相似，展示其中一次代表性实验的数据。

●细胞系实验：在 HMLE、MCF10AT 和 MDA-MB-231 细胞中过表达 SH3RF3，结果显示 CD44+CD24 - 细胞在 HMLE 和 MCF10AT 中比例增加，MDA-MB-231 中 ALDH + 亚群增多，且这三种细胞系的肿瘤球形成能力均显著增强。在小鼠乳腺癌细胞系 Py8119 中，Sh3rf3 在 ALDH + 亚群中表达上调，过表达 Sh3rf3 也增强了其肿瘤球形成能力。

●体内成瘤实验：将过表达 SH3RF3 的 MDA-MB-231 细胞和对照细胞进行有限稀释后原位移植到免疫缺陷小鼠体内。当注射较少细胞（如 40 个细胞）时，过表达组小鼠的肿瘤发生率更高，肿瘤体积更大，CSC 频率显著增加；在 HMLER 细胞中过表达 SH3RF3 也得到类似结果，表明 SH3RF3 过表达促进乳腺癌细胞在体内的肿瘤起始能力。

图 3：SH3RF3 敲低损害乳腺癌细胞的 CSC 特性

a：HMLER-CD44H 和 MCF10CA1h 细胞中 SH3RF3 的敲低情况。

b：HMLER-CD44H 中 CD44high 亚群和 MCF10CA1h 中 ALDH + 亚群的流式细胞术分析（n=3 次细胞培养实验）。

c：敲低 SH3RF3 的乳腺癌细胞中肿瘤球形成的定量分析及代表性图像（n=3 次球培养实验）。比例尺，100μm。

d：在第 42 天，注射连续稀释的 MCF10CA1h 细胞的小鼠体内肿瘤形成情况。

e：注射 200 个对照或敲低 SH3RF3 的 MCF10CA1h 细胞的小鼠的肿瘤图像和体积（n=8 只小鼠）。数据表示为平均值 ± 标准差。采用双尾无配对 t 检验（b 和 c）、卡方检验（d）或 Mann-Whitney U 检验（e）确定统计学意义。（a）、（b）（左）和（c）中的实验独立重复三次，结果相似，展示其中一次代表性实验的数据。

●敲低效果验证：在 HMLER-CD44H 和 MCF10CA1h 细胞系中使用多种 siRNAs 或 shRNAs 敲低 SH3RF3，Western blot 结果显示敲低效果显著。

●功能影响：敲低 SH3RF3 后，HMLER-CD44H 细胞中 CD44 高表达亚群比例明显下降，MCF10CA1h 细胞中 ALDH + 亚群显著减少，两种细胞系的肿瘤球形成能力均受损。

●体内实验：对敲低 SH3RF3 的 MCF10CA1h 细胞进行有限稀释后原位移植到小鼠体内，结果显示敲低组小鼠的肿瘤起始能力显著降低，肿瘤体积更小，表明 SH3RF3 对维持乳腺癌细胞的 CSC 特性至关重要。

图 4：PTX3 受 SH3RF3 调控并增强 BCSC 特性

a：HMLER 亚系中差异表达且受 SH3RF3 过表达调控的基因的表达热图。

b：过表达和敲低 SH3RF3 后，不同癌细胞系中 PTX3 mRNA 表达及其细胞外蛋白水平（n=3 次细胞培养）。

c：乳腺癌细胞系中 SH3RF3 和 PTX3 mRNA 水平的相关性（n=51 个细胞系）。

d：过表达 PTX3 和对照的 HMLE 细胞条件培养基中细胞外 PTX3 水平。

e：过表达 PTX3 后 HMLE 细胞的肿瘤球形成情况（n=3 次培养实验）。

f、g：过表达 PTX3 和对照的 HMLE 细胞中 CD44+CD24- CSC 亚群的流式细胞术分析（f）和定量分析（g）。比例尺，100μm；n=3 次细胞培养实验。

h：注射不同数量 HMLER 细胞的小鼠在第 90 天的肿瘤发生率。

i：过表达 PTX3 与对照细胞中 CSC 和 MaSC 相关基因集的 GSEA 分析。

j：过表达 PTX3 与对照细胞中 Hedgehog 和 Hippo 调控基因集的 GSEA 分析。

k：过表达 PTX3 后 Hedgehog 和 Hippo 调控基因的 mRNA 水平（n=3 次细胞培养实验）。数据表示为平均值 ± 标准差。采用配对 t 检验（c）或双尾无配对 t 检验（e、g 和 k）确定统计学意义。（b）、（d）、（e）、（f）和（k）中的实验独立重复三次，结果相似，展示其中一次代表性实验的数据。

●筛选与验证：对过表达 SH3RF3 的 MCF10AT 细胞进行 RNA 测序，与 HMLER 亚系差异表达基因重叠分析后，确定 PTX3 为关键基因。过表达和敲低 SH3RF3 实验表明，PTX3 在 RNA 和蛋白质水平受 SH3RF3 调控。分析癌细胞系表达数据库发现，SH3RF3 和 PTX3 在乳腺癌细胞系中的表达呈强正相关。

●PTX3 功能验证：在 HMLE、HMLER 和 MCF10AT 细胞中过表达 PTX3，细胞的肿瘤球形成能力增强，HMLE 中 CD44+CD24 - 亚群比例增加，HMLER 的体内成瘤能力提高。

●通路分析：对过表达 PTX3 的 HMLER 细胞进行 RNA 测序和 GSEA 分析，发现与 CSC 和乳腺干细胞（MaSC）相关的基因集在过表达 PTX3 的细胞中显著富集，同时 Hedgehog 和 YAP 信号通路相关基因集也显著富集，qRT-PCR 验证了相关基因的上调，表明 PTX3 可能通过调控这些通路发挥作用。

图 5：PTX3 介导 SH3RF3 在 BCSC 调控中的功能

a：乳腺癌细胞系中，PTX3 和 SH3RF3 过表达后调控的基因集的 ssGSEA 得分的相关性（n=51 个细胞系）。

b：过表达 PTX3 与对照细胞中 CD44 或 YAP 相关基因集的 GSEA 分析。

c：PTX3 和 SH3RF3 过表达后 Hedgehog 和 Hippo 调控基因的表达热图。

d：过表达 SH3RF3 的 MDA-MB-231 细胞中 PTX3 的敲低情况。

e：过表达 SH3RF3 且敲低 PTX3 的 MDA-MB-231 细胞中 ALDH + 亚群的流式细胞术分析。

f：过表达 SH3RF3 且敲低 PTX3 的 MDA-MB-231 细胞中 ALDH+ CSC 亚群的定量分析（n=4 次 FACS 实验）。

g：过表达 SH3RF3 且敲低 PTX3 的 MDA-MB-231 细胞中肿瘤球定量分析（n=3 次培养实验）。

h：在第 28 天，注射 40 个 MDA-MB-231 细胞的小鼠的肿瘤起始情况。数据表示为平均值 ± 标准差，n=3。采用配对 t 检验（a）或双尾无配对 t 检验（f 和 g）确定统计学意义。（d）、（e）和（g）中的实验独立重复三次，结果相似，展示其中一次代表性实验的数据。

●转录组相关性分析：ssGSEA 分析显示，在乳腺癌细胞系中，SH3RF3 和 PTX3 过表达调控的基因集的 ssGSEA 得分具有强相关性，且 PTX3 过表达细胞中富集的基因集在 SH3RF3 过表达时也显著富集，同时 SH3RF3 过表达也调控了 PTX3 调节的 Hedgehog 和 Hippo-YAP 下游基因，表明两者对癌细胞转录组的影响一致，尤其在与癌症干性相关基因方面。

●rescue 实验：在 MDA-MB-231 细胞中敲低 PTX3，流式细胞术分析显示，SH3RF3 过表达引起的 ALDH+ CSC 亚群扩张被抑制，肿瘤球形成能力也受到显著抑制。在体内实验中，敲低 PTX3 抑制了 SH3RF3 过表达对 MDA-MB-231 细胞体内成瘤的促进作用，表明 PTX3 在 SH3RF3 调控 BCSCs 中起关键介导作用。

图 6：SH3RF3 通过 JNK-JUN 通路增强 PTX3 表达

a、b：用 JNK（SP600125，5nM）、WNT（XAV939，5nM）和 NF-κB（BAY11-7082，5nM）抑制剂处理过表达 SH3RF3 和对照的 HMLE 细胞后，PTX3 表达（a）和肿瘤球形成（b，n=3 次培养实验）情况。

c、d：用 JNK 抑制剂处理过表达 SH3RF3 和对照的 MDA-MB-231 细胞后，PTX3 表达（c）和肿瘤球形成（d，n=3 次培养实验）情况。

e：过表达和敲低 SH3RF3 后 JNK 和 JUN 的磷酸化情况。

f：过表达 SH3RF3 后 HMLE 中 JUN 靶基因的表达（n=3 次 qRT-PCR 实验）。

g：HeLa 细胞中 JUN 与 PTX3 启动子结合的 ChIP-qPCR 分析（n=3 次 ChIP 实验）。

h：JUN 过表达和对照的 HeLa 细胞中 PTX3 启动子的荧光素酶报告分析（n=3 次报告实验）。数据表示为平均值 ± 标准差。采用双尾无配对 t 检验（a、b、d、f、g 和 h）确定统计学意义。（a - f）和（g）中的实验独立重复三次，结果相似，展示其中一次代表性实验的数据。

●通路筛选：用 PI3K、JNK、WNT 和 NF-κB 通路抑制剂处理 HMLE 细胞，发现 JNK 抑制剂（SP600125）能显著抑制 PTX3 表达和肿瘤球形成，消除 SH3RF3 的促进作用，而 PI3K 抑制剂虽抑制 PTX3 表达，但 SH3RF3 仍能上调 PTX3 表达和促进肿瘤球形成，且 SH3RF3 不影响 AKT 磷酸化，表明 SH3RF3 通过 PI3K 非依赖途径调控 PTX3。

●JNK 通路激活验证：在多种细胞系中过表达 SH3RF3，JNK1、JNK2 及下游转录因子 JUN 的磷酸化水平增加；敲低 SH3RF3 则抑制 JNK 和 JUN 的磷酸化。同时，过表达 SH3RF3 使已知的 JUN 靶基因（如 MMP3、CD44 等）显著上调。

●JUN 与 PTX3 关系验证：ChIP-qPCR 实验证实 JUN 能结合 PTX3 启动子，荧光素酶报告实验表明 JUN 可直接激活 PTX3 启动子转录活性，且 JUN 主要靶向 PTX3 启动子的 - 206 到 + 52 区域，该区域的三个 AP-1 结合位点对 JUN 调控 PTX3 表达至关重要。

图 7：SH3RF3 通过与 MKK 和 JNK 相互作用激活 JUN

a：293T 细胞中 SH3RF3 与 JNK1/2 相互作用的 Co-IP 分析。

b：293T 细胞中 SH3RF3 与 MKK4/7 相互作用的 Co-IP 分析。

c：293T 细胞中 SH3RF3 与 JIP3 相互作用的 Co-IP 分析。

d：293T 细胞中 SH3RF3-JIP3-MKK7 相互作用的顺序 Co-IP 分析。

e：MCF10AT 中 JIP3 与 MKK7 相互作用的 Co-IP 分析（上），以及过表达 SH3RF3 与否的情况（下）。

f：敲低 JIP3 与否的 MCF10AT 中 SH3RF3 与 JNK1/2 相互作用的 Co-IP 分析。

g：过表达 SH3RF3 和敲低 JIP3 后 MCF10AT 中 JUN 的磷酸化情况。

h：不同 SH3RF3 截断体与 MKK7、JIP3 和 JNK1 相互作用的 Co-IP 分析。实验独立重复三次，结果相似，展示其中一次代表性实验的数据。

●相互作用验证：Co-IP 实验表明 SH3RF3 与 JNK1、JNK2 以及 MKK4、MKK7 存在相互作用，同时 SH3RF3 能与 JIP 家族成员 JIP1、JIP2、JIP3 相互作用，在乳腺癌细胞 MCF10AT 中主要表达 JIP3，且 SH3RF3、MKK7 和 JIP3 存在于同一复合物中。

● 作用机制探究：SH3RF3 增强 JIP3 与 MKK7 的相互作用，但不影响 JIP3-JNK2 相互作用。敲低 JIP3 显著削弱 SH3RF3 与 JNK 蛋白的结合以及 SH3RF3 促进 JUN 磷酸化的作用。进一步研究发现，SH3RF3 的第四个 SH3 结构域与 MKK7 相互作用，第一和第二个 SH3 结构域分别与 JIP3 和 JNK1 相互作用，表明 SH3RF3 通过促进 MKK-JNK 复合物的组装激活 JNK-JUN 通路。

图 8：SH3RF3 在人类乳腺肿瘤中的临床相关性

a：过表达 SH3RF3 后，人乳腺肿瘤 LTMBC-1 来源的患者类器官形成情况（n=3 次类器官培养重复）。（右图）线表示中位数， whiskers 表示标准差。右图展示了一个代表性类器官的苏木精 - 伊红染色。比例尺，100μm。

b：过表达 SH3RF3 后，另外两个人乳腺肿瘤（LTMBC-2 和 3）来源的患者类器官形成情况（n=3 次类器官培养重复）。

c：过表达 SH3RF3 后，四个人胃癌（LTMGC-1、2、4 和 13）来源的患者类器官形成情况（n=3 次类器官培养重复）。比例尺，100μm。

d：TCGA 乳腺癌队列中 SH3RF3 和 PTX3 表达与不同 CSC 标记基因的相关性（n = 1097 例患者）。

e：TCGA 乳腺癌队列中 SH3RF3 表达与 CSC 和 MaSC 相关基因集的 ssGSEA 得分的相关性（n = 1097 例患者）。

f：Qilu 队列乳腺癌组织中 SH3RF3 和 CD44 的代表性 IF 图像。比例尺，100μm。

g：Qilu 队列中不同 SH3RF3 表达的乳腺癌组织中 CD44 表达水平（n = 40 例患者）。括号中的数字表示样本量。

h：Qilu 队列乳腺癌组织中 SH3RF3 和 CD44 IF 强度的相关性（n = 40）。

i：通过 Kaplan-Meier Plotter 乳腺癌队列（n = 626 例患者）中 SH3RF3 表达进行的生存分析。

j：SH3RF3 在 BCSC 调控中作用的示意图模型。数据表示为平均值 ± 标准差。采用双尾无配对 t 检验（a、b 和 c）、卡方检验（g）、配对 t 检验（h）或双侧对数秩检验（i）确定统计学意义。

●类器官实验：在患者来源的乳腺癌类器官培养实验中，过表达 SH3RF3 显著增加了三个乳腺癌患者来源肿瘤细胞形成的类器官数量和大小，在胃癌类器官培养中也得到类似结果，表明 SH3RF3 促进临床肿瘤细胞的 CSC 特性。

●临床数据分析：分析 TCGA 乳腺癌队列 RNA 测序数据，发现 SH3RF3 表达与 PTX3、CSC 标记基因（CD44、ALDH1A1/2/3）呈正相关，且 SH3RF3 表达与 CSC 和 MaSC 相关基因集的富集正相关。

●免疫荧光分析：对 40 例乳腺浸润性导管癌的 Qilu 队列进行免疫荧光染色，结果显示 SH3RF3 表达越高，CD44 + 细胞数量越多，两者信号强度呈正相关。

●预后分析：通过 Kaplan-Meier Plotter 数据库分析，发现 SH3RF3 高表达与乳腺癌患者远处转移风险增加和生存率降低相关；在 CPTAC 乳腺癌队列中，PTX3 高表达与疾病复发相关。

05研究结论 

SH3RF3 在乳腺癌干细胞中高表达，通过激活 JNK-JUN 通路上调 PTX3 表达，促进乳腺癌细胞的干细胞特性，与临床肿瘤的 CSC 富集和患者不良预后相关，为乳腺癌的治疗提供了潜在的新靶点和理论依据，但 PTX3 下游分子机制及 SH3RF3 在 JNK 信号通路中的具体作用仍需进一步研究 。

主营项目

1. 动物实验

动物饲养、疾病造模、行为学检测、心功能、无创血压、血常规、全自动生化检测等

2. 细胞实验

CCK8/MTT、原代细胞分离、流式细胞实验、细胞划痕、侵袭、迁移、EDU染色、转染、稳定株

3. 分子生物学

PCR检测、荧光定量PCR、绝对定量PCR、端粒酶长度、pull down、双荧光素酶、SSR、SNP检测等

4. 蛋白实验

WB、Co-IP、酵母双杂

5.病理实验

HE染色、免疫组学、电镜

6. 生理生化实验

肝肾功能、抗氧化、免疫反应等生理免疫指标;动植物营养指标、微量元素、重金属、酶活等。

7. 多组学实验

基因组、转录调控、蛋白组、代谢组、微生物多样性、宏基因组、生信分析

8. 整体课题实验

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