论文信息：

标题：A prospective study of neoadjuvant pembrolizumab plus chemotherapy for resectable esophagealsquamous cell carcinoma: The Keystone-001 trial

期刊：Cancer Cell

影响因子：48.8

作者：Xiaobin Shang, Yongjie Xie, Jinpu Yu3, Jun Yu, yujun, Jihui Hao, Haojihui, Hongjing Jiang

发表日期：2024年10月

doi: 10.1016/j.ccell.2024.09.008

关键词：食管鳞状细胞癌; 免疫检查点抑制剂; 单细胞RNA测序; T细胞受体γ链恒定区2, 新辅助治疗

实验设计总览

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研究队列

入组标准：

•组织学确诊为可切除（II-III期）食管鳞癌（ESCC）

• PD-L1 CPS ≥1（部分亚组分析要求）

•未接受过系统性抗肿瘤治疗

02

治疗方案与手术

(1)新辅助阶段：

帕博利珠单抗（200mg IV，Q3W） + 化疗（紫杉醇 175mg/m² + 顺铂 75mg/m²），共3周期。

(2)手术阶段：

新辅助治疗后4-6周行机器人辅助食管癌根治术（Ivor Lewis术式）。

(3)术后治疗：

实验组继续帕博利珠单抗辅助治疗（≤1年）。

03

疗效评估指标

结果

01

Figure1 

图1. Keystone-001研究的临床结局分析

(A) 患者流程图（Patient flow diagram）描述患者筛选、入组、排除及最终分析队列的流程。

(B) 泳道图（Swimmer plots）意向治疗人群（ITT，Intention-To-Treat population，n = 47）中每位患者的治疗时间线：新辅助治疗阶段（帕博利珠单抗联合化疗的用药周期与持续时间）,辅助治疗阶段（术后帕博利珠单抗维持治疗）,病理学结果（如主要病理缓解MPR、肿瘤残留比例）和随访状态（复发、死亡或生存）。(C) 总生存期（OS）的Kaplan-Meier曲线（Kaplan-Meier curves of Overall Survival）展示接受帕博利珠单抗（Pembrolizumab）联合化疗新辅助治疗并后续手术患者的总生存期（从入组至任何原因死亡的时间）。(D) 无病生存期（DFS）的Kaplan-Meier曲线（Kaplan-Meier curves of Disease-Free Survival）。

02

图2. 探索与对新辅助治疗的差异反应相关的特征性细胞亚群变化

(A)单细胞测序分析的工作流程图。(B)气泡图显示了从提交给分析以进行分析的样本中获得的单细胞测序数据的聚类分析。(C)-t分布随机邻域嵌入（t-SNE）图显示细胞聚类分析，使用Seurat的t-SNE算法对所有样本进行注释可视化。（D-G）t-SNE图显示了基于外周血来源(D)、肿瘤来源(E)、患者来源(F)和治疗反应(G)的细胞亚群。(H)条形图显示每个患者的每个细胞亚组按治疗反应所占的比例。(I)外周血和肿瘤组织中TRGC2+ NKT细胞的比例。箱形图分别显示了良好反应组和不良反应组在肿瘤组织和外周血中TRGC2+ NKT中的细胞比例。(J)有利反应组和不良反应组分别在治疗前后显示总NKT和TRGC2+ NKT的细胞比例的箱形图。

03

图3.外周血TRGC2+ NKT细胞群与对新辅助治疗的反应之间的关联。

(A)条形图显示了基于治疗反应的每个患者的细胞群比例。(B)显示所有NKT细胞群中差异表达基因的热图。(C)气泡图显示了TRGC2+ NKT细胞中的KEGG分析。(D)火山图显示了标记不同NKT细胞亚群差异的功能基因。从左到右分别是：TRGC2+ NKT细胞、IL7R+ CCR4+ NKT细胞、CD69+ NKT细胞、CCL4+ IFNG+ NKT细胞、CXCR4+ NKT细胞和PDCD1+ TIGIT+ NKT细胞。(E)显示不同NKT细胞亚群的伪时间轨迹的轨迹图。(F)曼哈顿图显示关键基因TRGC2、RRM2、IL7R、TK1、FGFBP2和NKG7的表达轨迹，红色表示TRGC2+ NKT细胞群。(G)全面的伪时间轨迹热图和通路富集图，显示了NKT细胞群中TRGC2+ NKT细胞群的特征功能、关键基因轨迹、通路富集分析和分化状态。

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图4.外周血和肿瘤组织中TRGC2+ NKT细胞亚组

(A)-分布随机邻包埋（(A)-SNE）图。(B) t-SNE图比较了两组患者在肿瘤组织中TRGC2+ NKTs的分布密度和比例的变化，并通过t-SNE图进行可视化。(C)火山图分别显示了肿瘤组织和外周血中TRGC2+ NKT在有利组和不利组之间的差异表达基因，以及TRGC2+ NKT在外周血和肿瘤组织之间的差异表达基因。(D)热图说明综合聚类分析结果显示组间基因表达特征。功能通路富集分析揭示了涉及差异表达基因的信号通路。(F)箱形图显示了三个不同的功能TRGC2+ NKT细胞组在有利反应组和不利反应组之间的比例。(G)条形图显示了肿瘤内三个细胞亚组在有利反应组和不良反应组之间的基因集评分的分布。(H)显示外周血中幼稚TRGC2+ NKT细胞亚群的时间分化轨迹的轨迹图。(I)系统发育树显示了TRGC2+ NKT细胞亚群从外周血到肿瘤组织的进化轨迹。(J)曼哈顿图显示了在不同TRGC2+ NKT细胞亚群的进化轨迹上显著改变的基因。(K)基因表达趋势图，显示TRGC2+ NKT细胞亚群从外周血到肿瘤组织的分子表达趋势。

05

图5.TRGC2+NKT细胞在食管鳞状细胞癌免疫治疗反应中作用的其他验证

(A) 工作流程示例说明了从4个不同患者的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离出的TRGC2+ NKT细胞。(C)细胞凋亡定量，数据显示为直方图。(D)方案从4例患者的PBMCs中分离TRGC2+和TRGC2- NKT细胞，然后分别与患者来源的类器官进行共培养实验。（E和F）类器官caspase 3中细胞凋亡的定量荧光检测；如图所示的类器官来自4个。

PART 03

核心发现

本研究为一项前瞻性II期临床试验，纳入47例局部晚期可切除食管鳞癌（ESCC）患者，采用 术前帕博利珠单抗（PD-1抑制剂）联合标准化疗序贯达芬奇机器人根治术 的创新策略。结果显示：①安全性卓越：新辅助治疗期间无≥3级免疫相关不良事件及手术延期，验证方案耐受性。②病理缓解突破：46例完成治疗患者中，主要病理缓解率（MPR）达72%（33/46），完全缓解率（pCR）为41%（19/46），显著高于历史新辅助化疗数据（MPR约20%-30%）。③生存获益显著：中位随访27.2个月后，2年总生存率（OS）与无病生存率（DFS）分别升至91%和89%，刷新局部晚期ESCC生存纪录。④机制深度解析：单细胞测序联合多队列验证揭示 外周血TRGC2+ NKT细胞扩增 为疗效预测关键标志物（AUC=0.86）；类器官共培养证实该亚群通过 IFN-γ/TNF-α双信号轴 诱导肿瘤细胞凋亡；跨癌种分析提示其免疫激活表型具广谱抗肿瘤潜力。

PART 04

创新点

本研究在食管鳞状细胞癌（ESCC）治疗领域实现了以下创新性突破：

1. 治疗策略革新  

率先将PD-1抑制剂（帕博利珠单抗）联合化疗应用于III期可切除ESCC的新辅助治疗，填补了该治疗方案在早中期患者群体中的循证空白。通过中位27.2个月的长期随访证实，其2年总生存率（91%）与无病生存率（89%）显著优于历史化疗数据，为优化临床实践提供了证据。

2. 全程管理理念创新

突破传统疗效评价框架，首次整合病理缓解率（MPR）、营养状态评估与生活质量评分等多维度指标，揭示新辅助治疗通过改善机体免疫营养微环境提升治疗耐受性，形成"疗效-生存质量"双获益模式。

3. 生物标志物发现  

运用单细胞多组学技术在国际上首次报道：外周血TRGC2+ NKT细胞动态变化与治疗应答显著相关。通过类器官共培养模型及空间转录组分析，阐明该亚群通过IFN-γ/TNF-α轴激活抗肿瘤免疫循环的作用机制，为液体活检指导精准治疗奠定理论基础。

3. 研究方法学创新

①创建"临床队列-单细胞测序-功能验证"三位一体研究范式。

②纵向采集治疗前后配对外周血与组织样本构建单细胞图谱。

③结合TCR克隆追踪与细胞通讯网络解析免疫重塑规律。  

该研究实现了从临床现象到分子机制的闭环验证，推动ESCC治疗进入免疫动态监控时代。

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